ROH检测系统的制作方法

本发明属于生物基因检测，具体涉及roh和单亲二体检测系统。

背景技术：

1、基因组纯合区域(runs of homozygosity，roh)是指基因组区域中呈现等位基因杂合性缺失现象。染色体缺失再复制、减数分裂错误和近亲等机制导致在该区域只有一类基因组(来自父本或母本)，则该区域为基因组纯合区域roh。

2、roh中最有代表性的一类即为单亲二体。单亲二体(uniparental disomy，upd)是指来自父母一方的染色体片段被另一方的同源部分取代，或一个个体的两条同源染色体都来自于同一个亲本。根据来源upd可分为：来自同一亲体的同一染色体的单亲同二体(isodisomy，isoupd)，分别来自同一亲体的两条同源染色体的单亲异二体(heterodisomy，hetupd)，同时存在单亲同二倍体和单亲异二倍体的混合单亲二体(mixed，mixupd)和染色体存在部分片段取代的片段单亲二体(segmental，segupd)。

3、染色体发生upd的现象在活产婴儿中约为1:3500，但有些类型upd患者无任何异常临床表型，还有些类型的upd甚至影响胚胎的生长发育而导致早期流产，因此染色体upd发生的概率可能高于1/3500。upd可以通过多种方式与疾病相关，包括印记障碍、原始非整倍体的低水平嵌合或仅由父母之一携带的致病性变异引起的隐性疾病的掩盖。人类6号染色体含有印记基因，目前的报道中基因plagl1(基因组位置：grch37.p13 chr6:144261437-144385736，6q24.2)和hymai(基因组位置：grch37.p13 chr6:144326053-144329396，6q24.2)的印记障碍会引发暂时性新生儿糖尿病(neonatal diabetes mellitus，tndm1，omim#601410)，plagl1或hymai通过单亲二体、染色体重复或印记松弛而导致的过度表达会引发tndm1。

4、短串联重复序列(short tandem repeats，str)通常是基因组中由1～6个碱基单元组成的一段dna重复序列，由于核心单位重复数目在个体间呈高度变异性并且数量丰富，构成了str基因座的遗传多态性。一般认为人类基因组平均每15kb就存在一个str基因座，占人类基因组序列的约7％，片段大小在70～500bp，并按孟德尔规律呈共显性遗传。然而仅通过str分型无法判别单亲同二体和染色体缺失变异。

5、因此开发str分型在upd检测方面的应用，对于产前筛查和相关疾病诊断都具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明开发了一种基于str二代测序检测染色体纯合区域roh和单亲二体的系统。

2、本发明首先提供一种str组合或str标志物，包含位于6号染色体上31个str位点及各位点上游1kb和下游1kb、或其片段，所述str位点包括：d6s477，d6s1279，d6s2439，d6s1960，d6s1053，d6s1275，d6s1052，d6s1043，d6s474，d6s1040，d6s2409，d6s1009，d6s970，d6s971，d6g15833，d6s2436，d6s1277，str_1278631，str_1279799，str_1280227，str_1280328，str_1281116，str_1281316，str_1281395，str_1281508，str_1281666，str_1282563，str_1282613，str_1282956，str_1283352，str_1283624。

3、在一个或多个实施方案中，所述str组合还包含作为内部参照的一个或多个str位点及各位点上游1kb和下游1kb、或其片段。

4、本发明还提供检测样品中本文任一实施方案所述str组合的试剂。

5、在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述str组合的序列杂交的引物分子，所述引物分子能扩增出所述str位点。

6、在一个或多个实施方案中，引物包括上游引物和下游引物。其中，上游引物包括，位于5’端的通用序列和位于3’端针对str位点的特异序列，上游引物的5’端与接头引物f的3’端的部分序列互补。下游引物包括，位于5’端的通用序列和位于3’端针对str位点的特异序列，下游引物的5’端与接头引物r的3’端的部分序列互补。

7、在一个或多个实施方案中，上游引物中针对str位点的特异序列包含如seq idno:6-36中的一个或多个或全部所示的序列。

8、在一个或多个实施方案中，下游引物中针对str位点的特异序列包含如seq idno:42-72中的一个或多个或全部所示的序列。

9、在一个或多个实施方案中，所述引物包含

10、(1)seq id no:78-108中的一个或多个或全部，和/或

11、(2)seq id no:114-144中的一个或多个或全部。

12、在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物，优选人。

13、在一个或多个实施方案中，所述样品是羊水、胚胎或体液。

14、本发明还提供检测本文任一实施方案所述str组合的试剂在制备诊断试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴定roh、鉴定单亲二体变异、判断单亲二体亲本来源、进行产前筛查或诊断。

15、在一个或多个实施方案中，所述试剂是本文任一实施方案所述的试剂。

16、在一个或多个实施方案中，所述鉴定roh、鉴定单亲二体变异、判断单亲二体亲本来源分别是鉴定6号染色体是否存在roh、鉴定6号染色体单亲二体变异、判断6号染色体单亲二体亲本来源。

17、本发明还提供一种鉴定染色体纯合区域roh、鉴定单亲二体变异、判断单亲二体亲本来源的方法，包括步骤：

18、(1)检测str组合的序列，所述str组合优选如本文任一实施方案所述，

19、(2)根据str组合的检测结果，确定str等位基因分型、各str相对测序深度差异和验证str连续区间，从而鉴定染色体是否包含roh，

20、任选的(3)根据家系样本的str等位基因分型和染色体是否包含roh，判断单亲二体、或单亲二体亲本来源。所述家系样本至少包含子代样本和至少一个亲本样本。

21、在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括构建包含所述str组合的文库并测序。

22、在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括步骤：(1.1)基因组dna提取，和(1.2)使用能扩增所述str组合的引物进行pcr，获得包含所述str组合的文库。步骤(1)还包括：(1.3)使用测序接头引物对文库进行pcr，获得包含所述str组合的测序文库。

23、在一个或多个实施方案中，步骤(2)中，当相对测序深度差异的平均值为0.7～1.4，并且连续区间内的str分型结果为：不存在连续3个及3个以上的str为一种分型(等位基因纯合，基因频率约为1)，则该连续区间排除roh；当str测序深度相对值为0.7～1.4(优选1.0)，并且连续区间内的str分型结果为：存在连续的3个及3个以上的str为一种分型(等位基因纯合，基因频率约为1)，则该str纯合基因范围存在roh。

24、在一个或多个实施方案中，步骤(3)中，根据str分型结果判断子代单亲二体和单亲二体的亲本来源。当连续区间内str均为一种分型(即基因纯合)，并且该连续区间内相对测序深度差异的平均值为0.7～1.4(优选1.0)，则该连续区间为单亲二体。当该连续区间内的str分型与某一亲本相同时，则该单亲二体来源于该亲本。

25、本发明另一方面还提供一种用于鉴定染色体纯合区域roh、鉴定单亲二体变异、判断单亲二体亲本来源的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：

26、(1)获取对象的样品中str组合的序列，所述str组合优选如本文任一实施方案所述，

27、(2)根据str组合的检测结果，确定str等位基因分型、各str测序深度相对值和验证str连续区间，从而鉴定染色体是否包含roh，

28、任选的(3)根据家系样本的str等位基因分型和染色体是否包含roh，判断单亲二体、或单亲二体亲本来源。所述家系样本至少包含子代样本和至少一个亲本样本。

29、在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括构建包含所述str组合的文库并测序。

30、在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括步骤：(1.1)基因组dna提取，和(1.2)使用能扩增所述str组合的引物进行pcr，获得包含所述str组合的文库。步骤(1)还包括：(1.3)使用测序接头引物对文库进行pcr，获得包含所述str组合的测序文库。

31、在一个或多个实施方案中，步骤(2)中，当相对测序深度差异的平均值为0.7～1.4，并且连续区间内的str分型结果为：不存在连续3个及3个以上的str为一种分型(等位基因纯合，基因频率约为1)，则该连续区间排除roh；当str测序深度相对值为0.7～1.4(优选1.0)，并且连续区间内的str分型结果为：存在连续的3个及3个以上的str为一种分型(等位基因纯合，基因频率约为1)，则该str纯合基因范围存在roh。

32、在一个或多个实施方案中，步骤(3)中，根据str分型结果判断子代单亲二体和单亲二体的亲本来源。当连续区间内str均为一种分型(即基因纯合)，并且该连续区间内相对测序深度差异的平均值为0.7～1.4(优选1.0)，则该连续区间为单亲二体。当该连续区间内的str分型与某一亲本相同时，则该单亲二体来源于该亲本。

33、本发明优点：

34、本发明所涉及的str检测系统，其str位点选择和引物设计，以及测序数据分析流程均是实验比较后较为良好的选择。

35、本发明所涉及的str检测系统适用于胚胎、羊水和血液等组织的6号染色体纯合区域roh和单亲二体检测，同时能排除6号染色体整倍体和大片段的数量异常。

36、本发明解决了以往染色体纯合区域roh和单亲二体检测通量低和成本高的问题，且检测速度快，操作简单，可用于产前筛查和遗传诊断。