一种基于自动荧光定量PCR算法的TaqMan探针法检测多种病原性真菌的方法与流程

本发明属于病原菌检测领域，具体公开了一种基于自动荧光定量pcr算法的taqman探针法检测多种病原性真菌的方法，还公开了用于上述检测方法的引物和探针的组合，以及由此制备的检测试剂盒。

背景技术：

1、侵袭性真菌感染一直是免疫抑制患者病情加重和死亡率增加的主要原因之一。而免疫抑制患者涉及hiv患者(3900万)、接受化疗的癌症病人(2000万)、器官移植病人(40万)等方面，全球总计接近6000万人。临床针对上述病人常采用抗真菌预防性治疗，即没有任何微生物学指征的情况下予以抗真菌药物治疗以预防侵袭性真菌感染事件的发生。抗真菌预防性治疗不仅浪费医疗资源和患者的钱财，而且会导致肝脏毒性、肾脏毒性等器官组织的毒副作用，进而加重上述人群的死亡风险。截至目前，已报道的能够引发侵袭性真菌感染的病原性真菌物种，以及潜在的致病性真菌高达637种，而能够在实验室条件下容易得到培养的真菌物种不超过病原性真菌物种总数量的15％。因此，借助分子手段开发针对病原性真菌物种的泛真菌检测工具是临床开展合理的抗真菌治疗的关键举措之一。

2、截止目前，关于病原性真菌的分子检测工具主要使用核糖体dna(18s或its)、保守的管家基因(chs1、拓扑异构酶ii)等。尽管上述的片段或者基因在不同的真菌之间存在一定的保守性，但是当前的分子检测工具主要通过保守区域和可变区域的结合来区分不同的病原性真菌类群(物种或者属水平)，尚未有研究者提出针对大部分病原性真菌的泛真菌检测工具的开发和探索，即对于上述hiv患者、接受化疗的癌症病人和器官移植患者等人群的筛选性质的泛真菌检测技术有待开发。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种基于自动荧光定量pcr算法的taqman探针法检测多种病原性真菌的方法。

2、本发明包括以下技术方案：

3、本发明公开了一种基于自动荧光定量pcr算法的taqman探针法检测多种病原性真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、(1)、模板dna提取：

5、(11)样本预处理：

6、(12)裂解体系配制：

7、(13)自动化提取核酸：

8、(14)收集dna：

9、(2)、taqman探针法qpcr扩增反应：

10、(3)、结果判定。

11、本发明还公开了一种同时鉴定多种病原性真菌的引物和探针组合，所述引物包括：

12、正向引物f1：5’-gcgcgytacactgacrgrgc-3’和

13、反向引物r1：5’-accttgttacgacttttasttcctctaaatgacc-3’；

14、所述探针为probe 1-mgb：5’6-fam-tcgtgctggggatagagcat-mgb 3’。

15、进一步的，本发明公开了一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂，包括上述的引物和探针组合。

16、进一步的，本发明公开了一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒，包括上述的引物和探针组合。

17、进一步的，上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒，所述试剂盒中包括taqman探针法qpcr扩增反应体系：

18、(1)反应液：aceq反应预混液：aceq u+probe master mix；

19、(2)引物液：包括正向引物f1、反向引物r1、探针probe 1-mgb，引物探针组合分别为：

20、正向引物f1：5’-gcgcgytacactgacrgrgc-3’；

21、反向引物r1：5’-accttgttacgacttttasttcctctaaatgacc-3’；

22、探针probe 1probe 1-mgb：

23、5’6-fam-tcgtgctggggatagagcat-mgb 3’；

24、(3)depc水：无核酸酶的灭菌水。

25、进一步的，上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒，所述正向引物f1、反向引物r1和探针probe 1-mgb的浓度均为10pmol/μl。

26、进一步的，本发明公开了上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒的应用，包括以下步骤：

27、(1)、模板dna提取：

28、(11)样本预处理：

29、(12)裂解体系配制：

30、(13)自动化提取核酸：

31、(14)收集dna：

32、(2)、taqman探针法qpcr扩增反应：

33、(3)、结果判定：

34、所述应用包括科研或者相关药品的研制，不包括疾病的诊断与治疗。

35、进一步的，上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒的应用，所述(11)中的样本包括痰液样本、肺泡灌洗液样本和临床分离的真菌中的一种或者多种。

36、进一步的，上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒的应用，所述(2)taqman探针法qpcr扩增反应包括以下步骤：

37、使用200μl pcr管配制反应体系，设置三个重复，正向引物f1和反向引物r1均为0.4μl，探针probe 1probe 1-mgb 0.3μl，aceq反应预混液10μl，模板dna加入2μl，用depc-水补齐到20μl，将反应液混合均匀后转移至96孔qpcr板，避免产生气泡；使用封板膜密封管口，将上述96孔反应管放置于qpcr仪器上进行扩增反应；反应程序如下：stage1 37℃，3min；stage2 95℃，5min；stage3(95℃，10s；70℃，20s)，40个循环。

38、进一步的，上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒的应用，所述(3)结果判定包括以下步骤：使用荧光pcr仪器实时检测反应管内的荧光信号，计算出实时扩增曲线，并借助基线判定出待测反应孔中的ct值，通过将ct值和扩增曲线的形状相结合来判断待测反应孔是阳性还是阴性，以及荷菌量的情况。

39、进一步的，上述一种同时鉴定多种病原性真菌的检测试剂盒的应用，所述(3)结果判定包括以下步骤：

40、(31)当阳性对照出现ct值和“s”形扩增曲线，以及阴性对照无ct值和“s”形扩增曲线，表明整个检测流程没有问题，待测样本的检测结果可信；

41、(32)当符合(1)的条件下，待测样本的检测孔出现ct值和“s”形扩增曲线，表明待测样本中病原性真菌为阳性，或者；待测样本的检测孔未出现ct值和“s”形扩增曲线，表明待测样本中病原性真菌为阴性；

42、(33)当符合(2)中检测阳性的条件下，结合标准曲线，ct每增加4左右，病原性真菌的含量降低10倍；

43、待测样本的检测孔的ct值满足如下情况，即为阳性检出，并且包含荷菌量的强度等级划分：即18≤ct≤22，强度等级为iv；22≤ct≤26，强度等级为iii；26≤ct≤30，强度等级为ii；30≤ct≤34，强度等级为i；

44、当阳性对照缺少ct值或“s”形扩增曲线，或者阴性对照出现ct值和“s”形扩增曲线，表明整个检测流程有问题，或者存在污染，待测样本的检测结果不可信，需要重新进行检测操作进一步判断待测样本中的情况。

45、本发明具有以下有益效果：

46、本发明属于病原菌检测领域，具体公开了一种基于自动荧光定量pcr算法的taqman探针法检测多种病原性真菌的方法，还公开了用于上述检测方法的引物和探针的组合，以及由此制备的检测试剂盒，具有以下优点：

47、(1)容易实现，本发明公开的引物和探针组合，以及由此制备的试剂盒操作简便，所使用的检测方法能在较短时间内(2～3小时)鉴定待测样本中是否存在病原性真菌，以及可能的真菌细胞数量；

48、(2)灵敏度高，18s rdna在病原性真菌中的拷贝数量在10～1200之间，绝大部分病原性真菌中的拷贝数量均在100以上，因此最低可检测出10个菌/ml；

49、(3)特异性好，本发明根据病原性真菌、人、模式植物和动物18s rdna序列的比对分析结果，设计特异性扩增病原性真菌的引物对，结合taqman探针实现特异性鉴定病原性真菌的目的，不会产生假阳性情况；

50、(4)覆盖范围广，本发明的检测范围纳入了所有可获得的病原性真菌的18s rdna序列，在保证特异性检测的基础上，能够实现同时对超过93％的病原性真菌的存在情况进行确定(理论上，经过比对，本发明有目标序列且被引物探针组合覆盖的病原性真菌有430种，而可获得18s序列的病原性真菌的有462种(表2)；

51、(5)应用场景广，本发明所述的试剂盒和方法适用于所有需要进行抗真菌预防性治疗的患者的病原性真菌的筛查。