用于修饰植物中的开花时间基因的方法和组合物与流程

本披露涉及植物生物。特别地，本发明涉及用于修饰光周期植物的开花时间和/或成熟时间以使得能够在具有不同昼长的多个地理位置中培育这些光周期植物的方法和组合物。

背景技术：

1、大豆(soybean，glycine max)是有价值的大田作物。从种子提取的大豆油用于许多零售产品，如烹饪油、烘焙食品、人造黄油等。大豆还用作谷物，作为动物和人二者的食物来源。大豆粕是许多食物和动物饲料的组分。从大豆生产的可食用蛋白质成分为肉类以及乳制品中的动物蛋白提供了更健康且更便宜的替代物。

2、全季大豆的典型生长周期开始于较长的营养生长期。如图1a所示，营养阶段开始于下胚轴从土壤中冒出(ve)，随后在子叶正上方的第一节上展开一对单叶的叶片(vc)。在此阶段，叶片充分展开，使得叶片边缘不接触。在vc之后，当三叶的叶片在多个节(n)的每一个处展开时，植物从v1(其中完全发育的叶片在第一节处展开)变为vn。

3、当第一朵开放的花存在于植物主茎上的任何节时，生殖阶段开始(r1或开始开花)。第一朵花典型地朝向植物的底部。当植物进入完全开花时，它进入r2。在这个阶段，在主茎上的两个最上面的节中的一个处存在开放的花，花完全发育。生殖阶段包括荚发育(r3和r4)、种子发育(r5和r6)以及最终成熟(r7和r8)。在r3(开始结荚阶段)中，在主茎上四个最上部具有完全发育叶片的节中的一个处存在至少十六分之三英寸长的荚。在r4(完全结荚)中，在主茎上四个最上部具有完全发育叶片的节中的一个处存在至少四分之三英寸长的荚。在r5(或开始结籽阶段)中，在主茎上四个最上部具有完全发育叶片的节中的一个处在荚中存在至少八分之一英寸长的种子。在r6(或完全结籽阶段)中，在主茎上四个最上部具有完全发育叶片的节中的一个处存在包含绿色种子的荚，绿色种子充满荚腔。在r7(或开始成熟阶段)中，在主茎上存在至少一个已达到其成熟荚颜色的正常荚。在r8(或完全成熟阶段)中，至少95％的荚已经达到其成熟荚颜色。r8后，需要五至10天的干燥天气以将大豆水分水平降低至小于15％。

4、大多数开花植物对每日光周期循环有反应，并且基于诱导开花所需的光周期条件，被分类为短日照(sd)或长日照(ld)植物。植物所经历的光周期条件又随着培育它们的地理位置(例如，纬度或经度)而变化。大豆是短日照(sd)植物，需要比临界值更短的天数来诱导开花。根据大豆品种对光周期的反应，如基于直至开花发生的天数，将大豆品种分为多个成熟期组。例如，对于大多数北美大豆品种，典型的种植日期为5月1日，大豆生长的营养期可以持续从55-65天，七月中旬左右开始开花。

5、植物育种者和种植者总是在寻找新的方法以操纵植物的培育和产量，尤其是对于农艺学而言重要的作物。例如，大豆育种者对可以在范围广泛的地理位置中培育的大豆品种感兴趣。因此，本领域持续需要修饰与开花时间相关的农艺性状的改进的组合物和方法。

6、已经鉴定并且发现了在控制大豆的开花时间和成熟中起作用的多种基因。本披露提供了产生参与大豆的光周期反应的基因的新型的且非天然的等位基因变异、以及使用特定的等位基因组合以提供具有一系列经修饰的开花时间的大豆植物的方法。

技术实现思路

1、提供了用于提供经编辑的植物(例如，大豆植物)的方法和系统，这些经编辑的植物具有从自然开花时间(例如，来自未经编辑的对应对照植物)改变或修饰的开花时间和/或成熟时间。在实施例中，大豆植物具有比对照植物的开花时间更少(例如，显著更少或略少)的开花时间和/或成熟时间。还提供了核酸分子的组合物(例如，表达盒或载体)，这些组合物能够将靶向编辑引入植物细胞的基因组中，特别是在参与调节开花和/或成熟和/或光周期反应的所选植物基因的基因座中处引入，从而导致产生开花和/或成熟和/或光周期反应基因的新型突变型等位基因。在实施例中，所得的突变型等位基因包含以下序列，这些序列当被包括在植物的基因组中时，与不包含突变型等位基因的植物相比，赋予植物经修饰的(例如，更少的)开花时间和/或成熟时间。在实施例中，与不包含等位基因组合的植物相比，由突变型等位基因的不同等位基因组合产生的组合物赋予植物经修饰的(例如，更短/更少的)开花天数、成熟天数和/或开花与成熟之间的天数。此类组合物和使用此类组合物的方法使得能够产生可以在多个地理位置(包括具有更短或更长日照的位置)中生长的植物。

2、本发明的实施例包括核酸分子，这些核酸分子包含编码在大豆植物或植物细胞的基因组的e1基因座和/或e1lb基因座处的突变的核苷酸序列，从而在e1基因座和/或e1lb基因座处产生新型的等位基因。在实施例中，通过表达盒引入突变，该表达盒包含编码在e1基因座和/或e1lb基因座处的突变的核酸序列，该e1基因座可操作地连接至启动子，该e1lb基因座可操作地连接至启动子(例如，相同或不同的启动子)。在实施例中，通过基因组编辑(例如，使用定点核酸酶的基因组修饰)将突变引入大豆植物基因组的e1基因座和/或e1lb基因座中。本发明的实施例包括在e1基因座和/或e1lb基因座处包含新型等位基因的植物或植物细胞。

3、本发明的另外的方法还包括使用诱变和重组(例如，使用嵌合寡核苷酸、兆核酸酶、锌指、talen或crispr进行定向)以引入特定的链断裂、重组插入和突变，以便工程化植物基因组中的原位变化，然后使得以此种方式突变的植物基因组在e1和/或e1lb基因座处改变。因此，该植物能够表达突变型e1蛋白和突变型e1lb蛋白中的一种或多种，并且因此使得该植物具有改变的开花时间特征。因此，本发明还包括改变开花时间的植物、品种以及它们的种子和后代，这些均源自本发明的上述方法的应用的产物。

4、本发明的实施例包括用于确立大豆植物或其种子应在何处生长的示例方法。在示例实施例中，该方法包括a)在大豆植物基因组的e1基因座和/或e1lb基因座处引入突变(如经由使用定点核酸酶的基因组修饰)；b)使该植物自交一代或多代，以产生在该e1基因座和该e1lb基因座中的每一个处纯合的后代植物；c)从所述后代植物获得dna；d)经由指示在该e1基因座处引入的突变类型的dna的第一测定以及指示在该e1lb基因座处引入的突变类型的dna的第二测定来确定所述后代植物的等位基因组合；以及e)基于所确定的等位基因组合指定该植物的开花时间的变化，其中该开花时间的变化是相对于不包含该等位基因组合的对照植物而言的。在实施例中，内源e1基因和e1lb基因的编辑包括使用dna修饰酶(例如，定点核酸酶)进行的编辑。在实施例中，编辑包括在植物基因组的e1基因座和e1lb基因座处的核定位信号(nls)处引入突变。在示例实施例中，编辑包括在e1基因座和/或e1lb基因座处(例如，在两个基因座处)的nls的碱性结构域处引入突变。在示例实施例中，编辑包括在e1基因座和e1lb基因座处的nls的两个碱性结构域中的第二碱性结构域处引入突变，其中第二碱性结构域相对于nls的第一碱性结构域在下游。在实施例中，编辑包括用表达盒转化植物细胞，该表达盒包含(i)编码定点核酸酶的核酸；以及(ii)编码针对靶序列的至少一种指导rna(grna)的核酸。在实施例中，该至少一种grna针对在该e1基因座和该e1lb基因座处的包含核定位信号(nls)的靶序列。在示例实施例中，该至少一种grna针对在该e1基因座和该e1lb基因座处的包含核定位信号(nls)的第二碱性结构域的靶序列。在实施例中，该编码该定点核酸酶的核酸可操作地连接至第一启动子，并且该编码该至少一种grna的核酸可操作地连接至第二启动子。在实施例中，该表达盒进一步包含可操作地连接至该第一启动子或该第二启动子的增强子。在实施例中，该定点核酸酶选自由以下组成的组：兆核酸酶(mn)、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、cas9核酸酶、cfp1核酸酶、dcas9-fokl、dcpf1-fokl、嵌合cas9-胞苷脱氨酶、嵌合cas9-腺嘌呤脱氨酶、嵌合fen1-fokl、和mega-tal、切口酶cas9(ncas9)、嵌合dcas9非fokl核酸酶和dcpfl非fokl核酸酶。在实施例中，该编辑包括向该e1基因座和该e1lb基因座中引入突变，该突变选自由以下组成的组：等位基因替代、一个或多个碱基插入、一个或多个碱基缺失。

5、在实施例中，该编辑进一步包括从该转化的植物细胞再生转化的t0植物，该转化的t0植物具有多个t1种子，其中该多个t1种子在该e1基因座和该e1lb基因座中含有多个独特的编辑；从该t1种子长成多个t1植物；使这些t1植物自交一代或多代，以获得在该e1基因座和该e1lb基因座处纯合的后代植物。在实施例中，该方法进一步包括对该后代植物的e1基因座和e1lb基因座进行测序；对该t0植物的e1基因座和e1lb基因座进行测序；将该后代植物的e1基因座和e1lb基因座序列与该后代植物的对应序列进行比对，以确定引入该e1基因座和该e1lb基因座中的突变的类型。

6、在实施例中，该等位基因组合包含：功能丧失的e1等位基因或部分功能的e1等位基因；以及功能丧失的e1lb等位基因或部分功能的e1lb等位基因。在实施例中，指定开花时间的变化包括指定相对于不包含该等位基因组合的对照植物而言的相对成熟期组值，其中任选地，该对照植物在该e1基因座和e1lb基因座中的每一个处包含野生型等位基因。在实施例中，指定开花时间的变化包括指定该大豆植物相对于该对照植物而言开花时间提前的天数。

7、在其他实施例中，提供了产生具有经修饰的开花时间的大豆植物的方法。在示例实施例中，该方法包括将编辑引入植物细胞的e1基因中以产生突变型e1等位基因，该突变型e1等位基因相对于野生型e1等位基因而言具有降低的e1蛋白功能；将另一编辑引入该植物细胞的e1lb基因中以产生突变型e1lb等位基因，该突变型e1lb等位基因相对于野生型e1lb等位基因而言具有降低的e1lb蛋白功能；以及从该经编辑的植物细胞再生经编辑的植物；以及使该经编辑的植物自交，以获得包含含有该突变型e1等位基因和该突变型e1lb等位基因的等位基因组合的经编辑的后代，其中相对于包含该野生型e1等位基因和/或该野生型e1lb等位基因的对照植物的开花时间而言，该经编辑的后代具有经修饰的开花时间。在实施例中，该方法包括将编辑引入e1基因中，包括将多个碱基对缺失引入e1基因中，其中该突变型e1等位基因编码包含框内缺失的突变型e1蛋白或截短的e1蛋白；并且其中，将该编辑引入e1lb基因中，包括将多个碱基对缺失引入e1lb基因中，其中该突变型e1lb等位基因编码具有框内缺失的突变型e1lb蛋白或截短的e1lb蛋白。在实施例中，该截短的e1蛋白相对于野生型e1蛋白而言没有功能活性，该框内缺失突变e1蛋白相对于该野生型e1蛋白而言具有部分功能活性，该截短的e1lb蛋白相对于野生型e1lb蛋白没有功能活性，并且该框内缺失突变e1lb蛋白相对于该野生型e1lb蛋白具有部分功能活性。

8、本发明的实施例进一步包括包含任何所列举的等位基因组合的经基因编辑的植物和经编辑的后代植物。在实施例中，该经编辑的后代植物的开花时间与该对照植物的开花时间相比是经修饰的(例如，更长或更短)。在实施例中，该经编辑的后代植物的相对成熟期组值不同于该对照植物的相对成熟期组值。

9、对序列表中的序列的简述

10、seq id no:1是来自大豆(g.max)的野生型e1基因的编码序列(cds)。

11、seq id no:2是由seq id no:1编码的野生型e1蛋白的氨基酸(aa)序列。

12、seq id no:3是来自大豆的野生型e1lb基因的编码序列(cds)。

13、seq id no:4是由seq id no:3编码的野生型e1lb蛋白的氨基酸(aa)序列。

14、seq id no:5是在seq id no:1的位置147至154处具有8bp缺失的突变e1等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1等位基因功能丧失。

15、seq id no:6是由seq id no:5编码的过早截短的e1蛋白的氨基酸(aa)序列。seqid no:6的截短蛋白不展示任何e1活性。

16、seq id no:7是在seq id no:1的位置144至156处具有13bp缺失的突变e1等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1等位基因功能丧失。seq id no:8是由seq id no:7编码的过早截短的e1蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:8的截短蛋白不展示任何e1活性。

17、seq id no:9是在seq id no:1的位置131至155处具有25bp缺失的突变e1等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1等位基因功能丧失。

18、seq id no:10是由seq id no:9编码的过早截短的e1蛋白的氨基酸(aa)序列。seqid no:10的截短蛋白不展示任何e1活性。

19、seq id no:11是在seq id no:1的位置146至154处具有9bp框内缺失的突变e1等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1等位基因具有部分功能。

20、seq id no:12是由seq id no:11编码的具有框内缺失的突变e1蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:12的框内缺失突变e1蛋白展示出降低的e1活性。

21、seq id no:13是在seq id no:1的位置145至159处具有15bp取代的突变e1等位基因的核苷酸序列。所得的框内缺失导致e1等位基因具有部分功能。

22、seq id no:14是由seq id no:13编码的过早截短的e1蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:14的框内缺失突变e1蛋白确实展示出降低的e1活性。

23、seq id no:15是在seq id no:3的位置149至155处具有7bp缺失的突变e1lb等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1lb等位基因功能丧失。

24、seq id no:16是由seq id no:15编码的过早截短的e1lb蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:16的截短蛋白不展示任何e1lb活性。

25、seq id no:17是在seq id no:3的位置13至151处具有139bp缺失的突变e1lb等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1lb等位基因功能丧失。

26、seq id no:18是由seq id no:17编码的过早截短的e1lb蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:18的截短蛋白不展示任何e1lb活性。

27、seq id no:19是在seq id no:3的位置149至151处具有3bp框内缺失的突变e1lb等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1lb等位基因具有部分功能。

28、seq id no:20是由seq id no:19编码的具有框内缺失的截短e1lb蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:20的框内缺失突变蛋白展示出降低的e1lb活性。

29、seq id no:21是在seq id no:3的位置149至154处具有6bp框内缺失的突变e1lb等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1lb等位基因具有部分功能。

30、seq id no:22是由seq id no:21编码的具有框内缺失的突变e1lb蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:22的框内缺失突变蛋白展示出降低的e1lb活性。

31、seq id no:23是在seq id no:3的位置148至156处具有9bp框内缺失的突变e1lb等位基因的核苷酸序列。缺失导致e1lb等位基因具有部分功能。

32、seq id no:24是由seq id no:22编码的具有框内缺失的突变e1lb蛋白的氨基酸(aa)序列。seq id no:22的框内缺失突变蛋白展示出降低的e1lb活性。

33、seq id no:25-26是在pcr过程中用于扩增e1lb等位基因的一组引物(分别为正向和反向引物)的核苷酸序列。

34、seq id no:27-28是在pcr过程中用于扩增e1等位基因的一组引物(分别为正向和反向引物)的核苷酸序列。

35、seq id no:29是用于对e1lb等位基因进行测序的引物的核苷酸序列。

36、seq id no:30是用于对e1等位基因进行测序的引物的核苷酸序列。

37、seq id no:31-32是在pcr过程中用于扩增lbcas12a基因的一组引物(分别为正向和反向引物)的核苷酸序列。

38、seq id no:33-34是在pcr过程中用于扩增adh基因的一组引物(分别为正向和反向引物)的核苷酸序列。

39、seq id no:35是用于检测lbcas12a的探针的核苷酸序列。

40、seq id no:36是用于检测adh的探针的核苷酸序列。

41、seq id no:37是合成指导rna(grna)的核苷酸序列，该合成指导rna用于靶向野生型e1和e1lb蛋白二者的核定位信号(nls)的第二碱性结构域，从而产生突变型e1和e1lb等位基因。