一种双黄败毒颗粒中有效成分同时测定的方法与流程

本发明属于兽药中有效成分检测领域，具体涉及一种双黄败毒颗粒中有效成分同时测定的方法。

背景技术：

1、双黄败毒颗粒为中兽药成方制剂，收载于《兽药质量标准2017年版》中药卷p106-108，处方为：黄连316g，黄芩316g，黄芪916g，茯苓468g，茵陈468g，蛇床子468g，黄精468g，连翘468g，五倍子396g，栀子316g，莪术200g，三棱200g；以上共12味药，煎煮3次，同时收集挥发油，煎液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15(80℃)的清膏，等分成两份，一份喷雾干燥成浸膏粉，作为制粒的母核，其余作为粘合剂，制粒，喷入挥发油，混匀，制成1000g，即得。双黄败毒颗粒为棕色至棕褐色颗粒，具有清肺解毒，益气固本，燥湿利胆的功效，主治热度雍盛所致的发热，神昏，咳喘，腹泻等症；广泛应用于集约化养鸡企业。

2、双黄败毒颗粒质量标准中有12味药，原国家标准方法中，以盐酸小檗碱的含量测定为标准，鉴别采用薄层色谱法，6个薄层色谱方法主要针对黄芪甲苷、蛇床子、没食子酸、栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷进行鉴别，含量测定采用流动相含有乙腈-1.36v％磷酸二氢钾溶液-0.68v％十二烷基硫酸钠溶液(体积比为100:50:50)为流动相，检测波长347nm，理论塔板数按盐酸小檗碱计算不低于5000。

3、但国家标准方法的薄层色谱检测方法中，斑点受环境温湿度和人为操作的影响大，斑点常常不清晰，结果不易判定，而且费时、费试剂。发明人在实际检验工作中发现，层析用的展开剂如甲苯、乙酸乙酯，三氯甲烷，甲醇，异丙醇，苯，正丁醇等毒性大，对实验人员的伤害比较大，操作繁琐，用时较多。另外，双黄败毒颗粒的薄层色谱检测前期准备复杂，需要展开，晾干，检视查看结果等多个步骤，费时费力，而且受环境温湿度等因素的干扰比较大，边缘效应等，薄层斑点有时方法难以判别，重现性差。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种双黄败毒颗粒中有效成分的同时测定方法。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、本发明的第一个方面，提供了一种双黄败毒颗粒中有效成分同时测定的方法，包括如下步骤：

4、将双黄败毒颗粒与提取剂混合后，进行超声提取，离心并过滤获得供试品溶液；将供试品溶液进行uplc-pda分析，得到供试品溶液的色谱图和光谱图；

5、通过所述色谱图和光谱图对双黄败毒颗粒中的盐酸小檗碱、绿原酸、滨蒿内酯、没食子酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷和栀子苷同时进行定性和定量分析；

6、所述提取剂为乙醇-磷酸溶液。

7、在本发明的一些实施例中，所述uplc-pda分析的色谱条件为：

8、色谱柱为hss t3，2.1mm×100mm，1.8μm；

9、3d扫描波长为190-400nm；

10、2d检测波长为210nm、229nm、232nm、238nm、278nm、324nm、347nm；

11、优选的，所述2d检测波长为229nm、238nm、278nm、324nm；

12、流动相采用梯度洗脱；

13、流动相a为0.05vol％磷酸的乙腈溶液，流动相b为0.05vol％磷酸水溶液。

14、在本发明的一些实施例中，以体积百分比计，所述梯度洗脱的程序为：

15、

16、在本发明的一些实施例中，所述双黄败毒颗粒与提取剂的固液比为4-16g/l；

17、所述提取剂中，乙醇与磷酸的体积比为(50-75)：(25-50)；

18、乙醇的浓度为95vol％，磷酸的浓度为0.1vol％。

19、发明人研究发现，目前国家标准薄层色谱中常采用甲醇或甲醇-盐酸作为提取剂，在实际检验工作中发现层析用的展开剂毒性大，对实验人员的伤害比较大，操作繁琐，用时较多。本发明选择毒性小的95vol％乙醇-0.1vol％磷酸溶液为提取剂进行提取，毒性小，化合物的峰面积响应值适中，样品处理简便、省试剂、省时间，使用的溶剂，操作安全环保，对人和环境危害小。同时，为了降低实验耗材有机溶媒的用量，发明人还尝试用去离子水作为双黄败毒颗粒的提取剂，但各种化合物的提取率都比较低，难以满足测试要求。

20、在本发明的一些实施例中，所述超声提取的时间为15-30min；所述离心的转速为10000-15000rpm/min，离心的时间为10-30min；所述过滤为通过微孔有机滤膜过滤；所述微孔有机滤膜为0.20-0.25μm聚四氟乙烯微孔滤膜；

21、优选的，所述超声提取的时间为15min；所述离心的转速为12000rpm/min，离心的时间为10min；所述微孔有机滤膜为0.22μm聚四氟乙烯微孔滤膜。

22、在本发明的一些实施例中，所述uplc-pda分析的色谱条件还包括，柱温为39-41℃；

23、进样量为0.2-5μl；优选的，所述进样量为1-2μl；

24、流动相的流速为0.34-0.36ml/min；优选的，所述流动相的流速为0.35ml/min。

25、在本发明的一些实施例中，还包括：

26、将盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷、绿原酸、滨蒿内酯、栀子苷和没食子酸对照品，分别溶于乙醇或甲醇中，配成各对照品溶液；再将各对照品溶液混合，配成对照品混合溶液；

27、将所述对照品混合溶液进行uplc-pda分析，得到对照品混合溶液的色谱图和光谱图；

28、根据所述对照品混合溶液的浓度、保留时间、光谱图和色谱图中的峰面积以及供试品溶液在色谱图中的峰面积，对供试品溶液中的盐酸小檗碱、绿原酸、滨蒿内酯、没食子酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷和栀子苷同时进行定性和定量分析。

29、在本发明的一些实施例中，所述各对照品溶液中，没食子酸对照品溶液的浓度为33.837-50.756μg/ml；绿原酸对照品溶液的浓度为149.692-224.539μg/ml；栀子苷对照品溶液的浓度为178.152-267.228μg/ml；滨蒿内酯对照品溶液的浓度为133.278-199.918μg/ml；盐酸小檗碱对照品溶液的浓度为257.464-386.196μg/ml；黄芩苷对照品溶液的浓度为186.898-280.347μg/ml；连翘苷对照品溶液的浓度为41.224-61.837μg/ml；黄芩素对照品溶液的浓度为123.873-185.810μg/ml；汉黄芩素对照品溶液的浓度为200.94-301.41μg/ml；

30、优选的，没食子酸对照品溶液的浓度为42.297μg/ml；绿原酸对照品溶液的浓度为187.116μg/ml；栀子苷对照品溶液的浓度为222.69μg/ml；滨蒿内酯对照品溶液的浓度为166.5986μg/ml；盐酸小檗碱对照品溶液的浓度为321.83μg/ml；黄芩苷对照品溶液的浓度为233.623μg/ml；连翘苷对照品溶液的浓度为51.531μg/ml；黄芩素对照品溶液的浓度为154.842μg/ml；汉黄芩素对照品溶液的浓度为251.175μg/ml；

31、或，所述对照品混合溶液中，没食子酸的浓度为6.76-10.15μg/ml；绿原酸的浓度为14.96-22.45μg/ml；栀子的浓度为17.81-26.72μg/ml；滨蒿内酯的浓度为10.66-15.99μg/ml；盐酸小檗碱的浓度为25.744-38.616μg/ml；黄芩苷的浓度为18.68-28.03μg/ml；连翘苷的浓度为8.24-12.37μg/ml；黄芩素的浓度为12.38-18.58μg/ml；汉黄芩素的浓度为4.01-6.02μg/ml；

32、优选的，所述对照品混合溶液中，没食子酸的浓度为8.46μg/ml；绿原酸的浓度为18.71μg/ml；栀子的浓度为22.27μg/ml；滨蒿内酯的浓度为13.33μg/ml；盐酸小檗碱的浓度为32.18μg/ml；黄芩苷的浓度为23.36μg/ml；连翘苷的浓度为10.31μg/ml；黄芩素的浓度为15.48μg/ml；汉黄芩素的浓度为5.02μg/ml。

33、在本发明的一些实施例中，所述uplc-pda分析的色谱条件还包括：

34、理论塔板数以黄芩苷计算达16.7万，以滨蒿内酯计算达11.0万，以没食子酸计能达0.41万，以绿原酸计算达2.58万，以栀子苷计算达4.68万，以连翘苷计算达18.8万，以盐酸小檗碱计算达13.9万。

35、本发明的第二个方面，提供了一种双黄败毒颗粒质量检测的方法，其包采用第一方面所述的方法对双黄败毒颗粒中的盐酸小檗碱、绿原酸、滨蒿内酯、没食子酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷和栀子苷进行定性和定量分析，将结果与标准比较，判定双黄败毒颗粒的质量。

36、本发明的有益效果为：

37、(1)本发明中通过液相色谱法将双黄败毒颗粒中黄连中盐酸小檗碱，黄芩中的黄芩苷、汉黄芩素和黄芩素，连翘中的连翘苷，茵陈中的绿原酸和滨蒿内酯，栀子中的栀子苷，五倍子中的没食子酸9种主要成分一次测定出来，方法简便快速、分离效果好，测定精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，又节省时间、试剂；从而替代了繁琐的大部分薄层检测。

38、(2)本发明的测定方法，放弃原国家标准薄层色谱中的甲醇或甲醇-盐酸作为提取溶剂，而是选择毒性小的95％乙醇-0.1％磷酸溶液为提取溶剂对供试品进行提取，毒性小，化合物的峰面积响应值适中，样品处理简便、省试剂、省时间，使用的溶剂，操作安全环保，对人和环境危害小。

39、(3)本发明的放弃了原标准中的含盐的流动相，采用磷酸来实现流动相酸度的调节，防止磷酸盐和十二烷基硫酸钠对色谱柱的堵塞，堵不仅缩短色谱柱的寿命，而且常常导致压力升高，从而损害色谱仪泵，加大维修维护费用的投入；并且以色谱图和光谱图的方式呈现结果，方便快捷，结果直观，容易判断，检测限低，大大缩短了检验时间(从样品处理到上机检测品判定结果，约1.5个小时可以检测完成，而原来国家标准中多个薄层检测方法，一个样品检测需要18-24小时)，提升了检验效率、检测灵敏度和检验效果。