一种食品原料粉中乳脂球膜蛋白的测定方法与流程

本发明涉及食品检测，具体涉及一种食品原料粉中乳脂球膜蛋白的测定方法。

背景技术：

1、乳脂肪是乳的主要成分之一，一般占乳成分的3%-5%，并以脂肪球的形式分散于乳中，在显微镜下观察为圆球形或椭圆球形，表面被一层10-20nm的膜所覆盖，称为乳脂肪球膜（milk fat globμle membran，mfgm）。乳脂肪球膜上存在２５%-７０%的膜蛋白，称为乳脂球膜蛋白（milk fat globμle membran proteins，mfgmp），利用蛋白质组学方法鉴定出的蛋白质的种类有120-170种。乳脂球膜蛋白具有丰富的开发利用价值。

2、mfgm主要由多种活性脂类和蛋白质构成，来自于泌乳期乳腺上皮细胞的内质网膜、顶端质膜和细胞质各区室，占乳脂肪球质量的2%-6%。mfgm上的脂质成分主要分为中性脂质和极性脂质。极性脂质占mfgm脂质成分的26%-40%，包括甘油磷脂[磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰丝氨酸(ps)和磷脂酰肌醇(pi)]和鞘脂[特别是鞘磷脂(sm)]。其中，pe、pc、sm的含量更为丰富，而ps和pi的含量较少。极性脂质的作用主要为调节脂质代谢、参与神经系统活动等方面。中性脂质包括甘油三酯、甾醇及甾醇酯(主要为胆固醇)、鞘糖脂(脑苷脂和神经节苷脂)，还有甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸等。其中，甘油三酯占mfgm脂质成分的56%-62%，是mfgm在分离纯化过程中的非膜脂质成分。另外，神经节苷脂具有调节肠道免疫、参与神经系统发育的功能。

3、mfgm上蛋白质占mfgm的25%-70%，占牛奶中总蛋白质含量的1%-4%，占乳脂球质量的1%。mfgm主要蛋白质包括8种，分别是黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(xo/xdh)、嗜乳脂蛋白(btn)、乳凝集素(mfde8/pas6/7)、黏液素1(mucl)、muc15/pasⅲ、分化抗原簇cd36(cd36/pasⅳ)、脂肪分化相关蛋白(adph)和脂肪相关键合蛋白(fabp)等，最后2种蛋白质为非糖基化蛋白。其中，母乳中mgfm上嗜乳脂蛋白含量高于牛乳，cd-36和乳凝集素的含量低于牛乳，其余均无差异。mfgm次要蛋白质包括糖基化的酶碳酸酐酶、牛奶碱陛磷酸酶(ap)、乳铁蛋白、骨桥蛋白(opn)和溶菌酶等，而后3种主要存在于乳清中，在较小程度上存在于m砌ⅲ中。

4、但是，目前比较缺乏食品中相对准确的乳脂球膜蛋白的测定方法。

5、中国专利申请cn103232991a公开了一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用，将磁性介孔硅材料分散至多巴胺水溶液中，加入磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，反应，洗涤；分散于磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应，洗涤；分散于含胰蛋白酶碳酸氢铵缓冲溶液中，反应，洗涤，制得。该材料以磁性微球为骨架，提供磁性，利于后续分离分析，具有较好的孔径分布和生物相容性，合成方法简单、成本低，可在孔道内部固定酶进行体积排阻选择性酶解。但是，该材料与磷脂不具有很好的相容性，从而难以应用于本发明中进行分离。

6、中国专利cn110252256b公开了一种磁性离子液体、其应用和改性活性炭及其制备方法。所述改性活性炭的制备方法，包括以下步骤：将所述的磁性离子液体与活性炭混合，于30-90℃反应2-24h，经分离处理，得到改性活性炭。本发明提供的改性活性炭吸附voc废气的饱和量显著增加，吸附效率提升，自燃点变高，爆炸下限也明显升高，燃爆可能性显著降低，此外，改性后的活性炭能够有效降低活性炭吸附环境中氧含量，能够进一步地降低气粉混合物的燃烧和爆炸的可能性。但是，该专利虽然公开了一种吸附性能好的改性活性炭，但是，该活性炭材料为无机结构，很难与有机的磷脂结构有很好的相容性，因此，限制了其在本发明领域中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种食品原料粉中乳脂球膜蛋白的测定方法，能够有效的测定食品原料粉中乳脂球膜蛋白的含量，准确度高，检出限低，线性关系良好，重复性和稳定性好，为其检测提供了便捷、灵敏的检测方法。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种食品原料粉中乳脂球膜蛋白的测定方法，包括以下步骤：

4、（1）样品前处理：称取样品加入水中，加入改性磁性颗粒，搅拌吸附，磁铁分离，将固体重新加入碳酸氢铵溶液中，超声提取，磁铁分离，液体定容，加入二硫酥糖醇溶液，恒温反应，冷却至室温后加入碘乙酰胺溶液，避光恒温反应，冷却至室温后加入胰蛋白酶溶液，恒温水浴酶解，冷却至室温后加入甲酸溶液，混匀后离心，经微孔滤膜过滤，即为试样测定液；

5、（2）色谱条件：色谱柱为c18色谱柱，内径，粒度；流动相中，a相为乙腈，b相为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；流速，0.2-0.3 ml/min；柱温：35-45℃；进样量：5μl；

6、（3）质谱条件：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；

7、（4）标准曲线的绘制：用混合标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物的浓度比为横坐标绘制标准曲线，标准工作液和待测样液中特征肽的响应值均应在仪器线性响应范围内；

8、（5）检测：采用步骤（2）和步骤（3）中的检测条件对步骤（1）中的试样测定液进行检测，用步骤（4）中的标准工作曲线对检测结果进行定量分析，计算，从而获得食品原料粉中乳脂球膜蛋白的含量。

9、作为本发明的进一步改进，所述改性磁性颗粒为表面烷基改性聚多巴胺包覆的磁性活性炭，制备方法如下：

10、s1. 将活性炭粉加入水中，加入氯化铁和氯化亚铁，惰性气体保护下，滴加氨水，加热搅拌反应，过滤，煅烧，洗涤，干燥，制得磁性活性炭；

11、s2. 将磁性活性炭加入水中，加入多巴胺盐酸盐和催化剂，加热搅拌反应，磁铁分离，洗涤，干燥，制得磁性颗粒；

12、s3. 将磁性颗粒加入二氯甲烷中，加入碱和氯代烷，室温搅拌反应，磁铁分离，洗涤，干燥，制得改性磁性颗粒。

13、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述活性炭粉、氯化铁、氯化亚铁、氨水的质量比为10:3.24:1.26:7-10，所述加热搅拌反应的温度为80-90℃，时间为2-4h，所述煅烧的温度为400-500℃，时间爱耐温1-2h；步骤s2中所述磁性活性炭、多巴胺盐酸盐和催化剂的质量比为10:3-5:0.1-0.5，所述催化剂为ph=8.5-9.5的tris-hcl溶液，所述加热搅拌反应的温度为40-45℃，时间为1-3h；步骤s3中所述磁性颗粒、碱和氯代烷的质量比为10:3-4:1-2，所述氯代烷选自1-氯十二烷、1-氯十四烷、1-氯十六烷、1-氯十八烷中的至少一种，所述碱为naoh、koh或三乙胺，所述室温搅拌反应的时间为2-3h。

14、作为本发明的进一步改进，步骤（1）中所述碳酸氢铵溶液的浓度为45-55mmol/l，所述超声提取的功率为1000-2000w，时间为20-40min，所述二硫酥糖醇溶液的浓度为90-110mmol/l，所述恒温反应的温度为55-65℃，时间为0.5-1h；所述碘乙酰胺溶液的浓度为90-110mmol/l，所述避光恒温反应的温度为25-35℃，时间为20-40min，所述甲酸溶液的浓度为3-7wt%，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.5-1.5mg/ml，所述恒温水浴酶解的温度为35-40℃，时间为10-12h，所述微孔滤膜的孔径为。

15、作为本发明的进一步改进，步骤（4）中混合标准工作溶液的制备方法如下：将混合标准液用0.2%甲酸-5%乙腈混合溶液稀释至10 μg/ml和1μg/ml的混合标准稀释液，然后分别移取1μg/ml的混合标准稀释液0 μl、2.5 μl、5μl、10 μl、25 μl以及10 μg/ml的混合标准稀释液5μl、10 μl、25 μl、50 μl、100 μl，均加入50 μl混合内标工作液，用0.2%甲酸-5%乙腈定容至1 ml，配制成0、2.5、5、10、25、50、100、250、500、1000 ng/ml系列浓度的标准工作溶液。

16、作为本发明的进一步改进，所述混合内标工作液的配制方法如下：用0.2%甲酸-5%乙腈混合溶液配置混合内标物，每一种内标物稀释至10μg/ml；所述混合内标物为同位素标记的xdh-vrh、同位素标记的muc1-ekh、同位素标记的adpn-drh、同位素标记的btn-trh和同位素标记的pas6/7-qrh，其中，同位素标记的xdh-vrh的肽链为：，同位素标记的muc1-ekh的肽链为，同位素标记的adpn-drh的肽链为，同位素标记的btn-trh的肽链为，同位素标记的pas6/7-qrh的肽链为。

17、作为本发明的进一步改进，所述混合标准液的配制方法如下：称取特异肽标准品，用0.2%甲酸-5%乙腈混合溶液配制成分别为500 μg/ml的混合标准液，所述特异肽标准品为xdh-vr、muc1-ek、adpn-dr、btn-tr和pas6/7-qr，所述xdh-vr的肽链为：vslsttgfyr，muc1-ek的肽链为：egttaewvk，adpn-dr的肽链为：dsvastitgvvdr，btn-tr的肽链为：tplplagppr，pas6/7-qr的肽链为：qfqfiqvagr。

18、作为本发明的进一步改进，所述特征肽muc1-ek、xdh-vr、btn-tr、adpn-dr、pas6/7-qr的保留时间分别为5.74min、6.09min、6.07min、6.26min和6.32min。

19、作为本发明的进一步改进，所述试样中特征肽的含量的计算方法公式如下，计算结果扣除空白值：；式中：x——试样中各特征肽的含量（分别是xmuc1-ek、xbtn-tr、xadpn-dr、xpas6/7-qr、xxdh-vr），单位为毫克每克（mg/g）；——试样的质量，单位为克（g）；——试样的定容体积，单位为毫升（ml）；——样液中各特征肽的浓度，单位为纳克每毫升（ng /ml）。

20、作为本发明的进一步改进，所述食品原料粉中乳脂球膜蛋白的含量的计算公式如下：w总＝w粘蛋白-1＋w嗜乳脂蛋白＋w亲脂素＋w乳凝集素＋w黄嘌呤脱氢酶

21、式中：w总——试样中乳脂球膜蛋白的总含量，单位为毫克每克（mg/g）；w粘蛋白-1——试样中粘蛋白-1的含量，，单位为毫克每克（mg/g）；w嗜乳脂蛋白——试样中嗜乳脂蛋白的含量，，单位为毫克每克（mg/g）；w亲脂素——试样中亲脂素的含量，，单位为毫克每克（mg/g）；w乳凝集素——试样中乳凝集素的含量，，单位为毫克每克（mg/g）；w黄嘌呤脱氢酶——试样中黄嘌呤脱氢酶的含量，，单位为毫克每克（mg/g）。

22、本发明具有如下有益效果：

23、本发明在前处理过程中，加入改性磁性颗粒，所述改性磁性颗粒为表面烷基改性聚多巴胺包覆的磁性活性炭，不仅具有较大的比表面积，能够提高对样品中蛋白的吸附量，同时，表面经过聚多巴胺改性后，且再其表面与氯代烷反应，从而引入了长链烷基，长链烷基与磷脂可以有较好的结合能力，从而使得其对能够对原料中乳脂球膜蛋白有很好的特异性吸附，从而有效分离了原料中的乳脂球膜蛋白。

24、然后将分离得到的固体重新加入碳酸氢铵溶液，碳酸氢铵是一种温和的变性剂，它可以改变蛋白质的电荷状态，从而促进蛋白质从乳脂肪球膜上解离出来，碳酸氢铵溶液的ph值接近蛋白质的等电点，这有助于减少蛋白质之间的相互作用，使得蛋白质更容易被提取出来。此外，碳酸氢铵溶液还可以帮助破坏蛋白质的二级和三级结构，从而使其更容易被胰蛋白酶等酶解。

25、本发明经过碳酸氢铵溶液超声提取，冷却至室温并定容，加入同位素内标，随后加入二硫酥糖醇(dtt)将蛋白质中或间的二硫键打开，用碘乙酰胺保护，加入过量的碱性胰蛋白酶在37℃下经酶解，选择各特异性肽，经反相色谱分离、四级杆串联质谱仪测定，内标法定量，从而能够有效的测定食品原料粉中乳脂球膜蛋白的含量，准确度高，检出限低，线性关系良好，重复性和稳定性好，为其检测提供了便捷、灵敏的检测方法。