一种在线同时表征蛋白质二硫键和序列信息的方法与流程

本发明涉及生物工程，具体涉及一种在线同时表征蛋白质二硫键和序列信息的方法。

背景技术：

1、二硫键(s-s键)是蛋白质在细胞内生物合成过程中，在两个半胱氨酸(cys)基团的硫原子之间形成的翻译后修饰，对蛋白质结构、稳定性和生物功能至关重要(woycechowskyk j,raines r t.native disulfide bond formation in proteins[j].current opinionin chemical biology，2000，4(5):533-539.)。单克隆抗体药物(mab)是高度二硫键结合的重组蛋白，理论上，每个亚型都有明确的二硫键结构。非天然的二硫键配对影响生物治疗药物的稳定性、潜在效力或生物学功能，因此二硫键连接和半胱氨酸相关变异体也成为抗体药物质量监控的重点(kleinberg a,joseph r,mao y,et al.ultrasensitive disulfidescrambling analysis of mabs by lc-ms with post-column reduction and glycinesignal enhancement[j].analytical biochemistry，2022:114773.)。氨基酸序列决定一级结构，不同的序列拥有其特异性指纹图谱。

2、已有报道的抗体二硫键表征方法为变性后酶解，样品一分为二：一部分直接进样，另一部分还原、烷基化后进样分析(吕锋华，环民霞，刘周阳，谭青乔.igg2型单抗二硫键配对分析方法[p].上海市：cn106153746b,2020-11-06.)。

3、氨基酸序列表征通常是包括top-down、middle-down及bottom-up三种策略，hunt等采用电子转移裂解(etd)碎裂模式从middle-down和bottom-up两个层面对单抗序列和翻译后修饰进行表征，序列覆盖度达到95％，通过etd和离子-离子质子转移化学(iipc，ion-ion proton transfer chemistry)结合进行二硫键的定位分析(hunt donald f.,wangweihan,zhang lichao.compositions and methods for analysis of proteinsequences and post-translational modifications[p].:us10281473，2019-05-07.)。

4、其中，bottom-up肽图方法较为通用，其前处理包括变性、还原、烷基化、置换缓冲溶液后酶解，猝灭后进行lc-ms分析，与二硫键分析最主要的差异即是还原步骤。hcd是高能碰撞裂解方式，属于质谱碎裂目标离子的一种模式，通过hcd可以将质谱的母离子进行二级碎裂，产生更小的子离子，从而进行质核比的归属分析。且hcd模式裂解的位点是酰胺键，产生的是b、y离子，不会断裂s-s键。因采用hcd无法碎裂二硫键，肽图与二硫键样品需分别进行前处理后再分别进样分析，目前暂未有方法同时表征二硫键和序列双重信息。

技术实现思路

1、为解决现有技术中缺乏同时表征二硫键和序列双重信息的方法的缺陷，本发明提供了一种在线同时表征蛋白质二硫键和序列信息的方法。本发明开发的兼具高灵敏度和高通量的结构表征方法应用于蛋白质例如抗体药物的质量控制，使用在线部分还原法能够在一次进样后所出图谱中同时表征二硫键和序列信息。

2、发明人发现，将hcd与etd(电子转移裂解)模式(产生c、z离子，能对s-s键进行碎裂)进行对比，在线部分还原后的样品经hcd模式下产生的二级碎片与etd及其他联用裂解技术都能实现二硫键的检测，而hcd能提供更多序列碎片信息。但目前已有研究是采用tcep完全还原后进行hcd模式的二级质谱分析蛋白质氨基酸序列，不能表征二硫键的信息。而本发明独树一帜地采用tcep试剂进行含有二硫键肽段的部分还原，其产物是既含有还原后游离肽段，又含有未还原的二硫键相连接的肽段，通过前处理的优化，采用部分还原法可以实现质谱hcd模式下对一级结构全面表征。

3、具体地，本发明在基于hcd模式下，只需通过一次样品前处理制备出待测蛋白质样品例如单抗样品(单抗包括完整型和fab片段型)后，通过一针进样lc-ms/ms分析即可实现序列信息和二硫键连接关系(包括未配对的游离半胱氨酸)的同时表征，无需采用etd及其他碎裂模式，方法通用性和普适性高。高效的还原试剂是实现半自动化还原处理的基础，部分还原可以将两次前处理和进样过程缩减至一次制备和进样分析，操作简单，减少处理和采集时间以及样品的用量；同时保证测定批次间的重复性，一定程度地降低偶然误差和人为不可控因素，提高方法和结果的可重现性，加速前期方法优化、抗体药物结构表征效率以缩短研发和生产周期。

4、本发明旨在解决现有技术需通过多次前处理和进样步骤的耗时耗力问题，该方法采用在线处理方法缩短了处理和分析时间，前处理操作简单，自动化衍生反应，减少了人为引入的不可控因素，方法可靠、稳定，为高通量抗体结构表征提供参考。本发明的方法与现有技术相比其优势在于：1、高通量表征：能够减少前处理步骤、减少样品和流动相的消耗、缩短液相质谱检测时间，便于样品前期的研发，能够快速获得多重信息；2、半自动化前处理：在线模式使方法重复性高，在线还原步骤也能够实现实时监测样品酶解效率。

5、为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种在线同时表征蛋白质二硫键和序列信息的方法，其基于hcd模式下，通过在线衍生系统，将蛋白样品与还原试剂经部分还原反应后再进行分析。

6、在某些实施方案中，所述方法满足以下一个或一个以上的条件：

7、所述在线衍生系统使用液相自动进样器，例如为u3000液相自动进样器。例如，所述蛋白样品可放置reagent a或reagent b，所述还原试剂可放置reagent a或reagent b。

8、所述蛋白质为抗体，优选单抗，例如为完整型或fab片段型单抗。

9、所述还原试剂为dtt或tcep。

10、较佳地，所述单抗为贝伐珠单抗或雷珠单抗。

11、由于在线部分还原后的样品经hcd模式下产生的二级碎片，即可实现二硫键的检测，因此本发明提供的技术方案除了检测单抗，还可以检测其他蛋白，只要其富含二硫键即可。

12、更佳地，所述在线衍生系统的吸样速度为0.2～5μl/s，和/或混合次数为2～10次例如为3、4、5、7、9次。优选为4次。

13、当吸样量为10μl时，所述吸样速度为1～5μl/s，

14、当吸样量为2μl时，所述吸样速度为0.2～1μl/s。

15、在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤包：蛋白变性、置换缓冲溶液、酶解、进样、检测和数据分析中的一种或多种。优选地，所述蛋白变性中还包括烷基化。

16、在某些实施方案中，所述酶解包括单酶酶解或多酶酶解。优选地，所述单酶为胰蛋白酶，和/或，所述多酶酶解为双酶酶解。更优选地，所述双酶酶解为胰蛋白酶和v8蛋白酶，或，胰蛋白酶和糜蛋白酶。

17、在某些实施方案中，所述还原试剂的终浓度为1～100mm，优选为2.5～50mm，更优选为2.5～40mm，进一步更优选为20mm。

18、在某些实施方案中，所述还原试剂的反应时间为1～30分钟，优选为3～10分钟，更优选为5分钟。

19、在某些实施方案中，所述蛋白变性使用蛋白变性试剂例如为尿素或盐酸胍，所述烷基化使用可使游离巯基的末端封闭的封闭试剂，其中，所述封闭试剂为可逆巯基修饰试剂或不可逆巯基修饰试剂。

20、所述封闭试剂为碘乙酰胺(iam)、n-乙基马来酰亚胺(nem)或碘乙酸(iaa)。优选地，所述蛋白变性试剂的终浓度为1～25m，和/或

21、所述封闭试剂的终浓度为1～1000mm。

22、更优选地，所述蛋白变性试剂的工作浓度为5～15m，

23、所述封闭试剂的终浓度为10～100mm。

24、进一步更优选地，所述蛋白变性试剂的工作浓度为6～8m，

25、所述封闭试剂的终浓度为25mm。

26、在某些实施方案中，所述置换缓冲溶液使用tris缓冲液或nh4hco3缓冲液。优选地，所述置换缓冲液的工作浓度为10～200mm。更优选地，所述置换缓冲液的工作浓度为25～100mm。进一步更优选地，所述置换缓冲液工作浓度为50mm。

27、在某些实施方案中，所述检测使用lc-esi-q exactive hf-x ms进行。优选地，所述检测使用梯度洗脱，所述梯度洗脱使用的a相和b相分别为0.05～0.2％甲酸和0.05～0.2％甲酸乙腈。

28、更优选地，所述梯度洗脱的流速为0.1～1ml/min，和/或，

29、所述梯度洗脱的条件为2％b相0.5～1.5ml，2～38％b相20～30ml，38～90％b相0.75～2ml，90％b相0.75～2ml，90％～1％b相0.25～1ml，2％b相0.5～1.5ml。

30、在某些实施方案中，所述梯度洗脱使用的a相和b相分别为0.1％甲酸和0.1％甲酸乙腈，

31、所述梯度洗脱的流速为0.25ml/min；

32、所述梯度洗脱的条件为2％b相0.75ml，2～38％b相24.25ml，38～90％b相1.25ml，90％b相1.25ml，90％～1％b相0.25ml，2％b相1ml。

33、在某些实施方案中，所述数据分析使用biopharma finder 4.0。

34、优选地，所述数据分析满足以下条件的一种或多种：

35、所述解析的处理参数最大质量为1000-10000，

36、所述解析的最低置信度为50％-100％，

37、所述解析的信号阈值为1.00e4-1.00e6，

38、所述解析的质量准确度为±1-50ppm。

39、更优选地，所述最大质量为2000-8000，

40、所述最低置信度为70％-90％，

41、所述信号阈值为1.00e5-9.00e5，

42、所述质量准确度为±1-10ppm。

43、进一步更优选地，所述最大质量为4000，

44、所述最低置信度为80％，

45、所述信号阈值为4.00e5，

46、所述质量准确度为±5ppm。

47、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

48、本发明所用试剂和原料均市售可得。

49、本发明的积极进步效果在于：本方法与传统方法相比，基于hcd模式下的lc-ms/ms，只需通过一次样品前处理制备出待测样品后，通过一针进样分析即可实现序列信息和二硫键连接关系的同时表征。其一，采用在线方法进行方法优化和样品测定操作简便，将还原所需的条件编写进程序即可实现自动取样和衍生，适用于高通量样品检测及前期的方法开发阶段；重复性试验显示，在线程序的重复性明显优于离线还原方法，减少了人为因素的干扰；除此之外，抗体药物往往样品量少、价格昂贵，在线还原程序一定程度上能够减少样品用量。其二，部分还原法缩短了处理和分析时间，能够在一针进样中同时实现一级结构的全面表征，包括序列信息和二硫键(及游离半胱氨酸)；其三，hcd模式在质谱中较为常用，对仪器要求不高，因此该方法具有通用性和普适性。