一种阳离子脂质YK-009中有关物质的检测方法及其应用与流程

本发明属于药物检测，具体涉及一种阳离子脂质yk-009中有关物质的检测方法及其应用。

背景技术：

1、自新型冠状病毒感染mrna疫苗成功上市以来，脂质纳米颗粒（lnp）已成为mrna、sirna等核酸制品的优先递送载体，广泛用于mrna疫苗及治疗药物。mrna分子量大，亲水性强，生物活性是小分子药物的上千倍，工业生产比较容易。但自身的单链结构致使其极为不稳定，易被降解，且自身携带负电荷，要穿过表面同为负电荷的细胞膜，使得其递送难度较高。lnp是一种多组分系统，可将mrna包裹在结构内部空腔中，这种结构可以提高mrna体内稳定性使其免受降解，进而发挥作用。

2、脂质纳米粒(lnp)是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，广泛用于rna疫苗和和核酸药物的递送，lnp的封装可以保护mrna不受细胞外rna酶的影响，并协助mrna的胞内递送。lnp因具有操作简便、生物安全性高、重复性好、转染效率较高、细胞毒性较小等特点而成为目前应用最为广泛的非病毒载体。biontech、moderna和curevac三巨头的mrna新型冠状病毒感染疫苗均采用lnp递送技术。

3、lnp递送系统主要由电离阳离子脂质（sm102或alc-0315或yk-009）、磷脂（dspc或dope）、胆固醇和辅助脂质（dmg-peg2000）配制脂质处方，四种脂质通常的摩尔比为50:10:38.5:1.5，可电离阳离子脂质与rna的比率保持在15:1（w/w），所以阳离子脂质在每一个单位制剂中的使用量非常大。可电离脂质在酸性条件下质子化，带正电荷，与带负电荷的核酸磷酸骨架发生静电结合，导致rna药物物质被包裹，从而形成脂质纳米颗粒，确保mrna的稳定性，lnps会通过受体介导的内吞作用被细胞摄取，lnp被细胞摄取后，会进入内涵体。可电离脂质在内涵体的酸性环境中质子化，带正电荷，这有助于破坏内涵体膜，使lnp能够逃逸到细胞质中。内涵体逃逸后，mrna从lnp中释放出来，进入细胞质，同时大量的可电离阳离子脂质，留在细胞内，这些片段可以与细胞成分相互作用，可在细胞内引起各种不良效应：阳离子脂质的正电荷可以与细胞成分的负电荷发生反应，导致膜孔隙性和钙离子内流，这可能导致细胞死亡；阳离子脂质可以通过干扰氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢和增加氧化应激来影响肝细胞（目前大多lnp是靶向肝脏的）；阳离子脂质与线粒体膜的负电荷相互作用可能会破坏其完整性，导致细胞中活性氧ros的释放，可能引发指数级的细胞损伤；如果阳离子脂质到达大脑的某些区域，会引起严重的神经系统效应。

4、由于阳离子脂质用量大，体内滞留时间长，相对的如果有微量的杂质存在，就会导致体内绝对数量杂质的增加；而这些杂质的结构中，通常也含有类似的阳离子结构和亲脂的不容易代谢的基因，会引发许多不可预知的细胞毒性；因此严格限定阳离子中的杂质含量，并寻找科学的质量检测方法，来严控杂质限量，是非常必要和必须的；遗憾的是，检索现有文献中，针对已经上市的阳离子脂质或者已经公开的阳离子脂质，没有能够找到非常科学的质量控制方法。

5、yk-009（c40h79no5）为悦康药业集团股份有限公司自主研发的第三代阳离子脂质体。与dlin-mc3-dma制成的第二代lnp相比，yk-009脂质体制成的lnp具有更小的粒径尺寸，更高的均一度，更高的体外细胞转染效率、更低的细胞毒性和高度的生物体内表达等优点，但其合成过程较复杂，过程中会产生一系列性质相似的杂质，包括中间体、降解杂质、副产物及副产物的衍生杂质。由于这些杂质与yk-009的结构中均无明显的发色基团且性质非常接近，因此yk-009与其杂质（有关物质）的分离难度较大，尚未检索到记载yk-009或者其他近似阳离子中的有关物质的分离检测方法。

6、

7、因此，如何提供一种能够有效检出yk-009中有关物质的方法，成为了亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种阳离子脂质yk-009中有关物质的检测方法及其应用。本发明提供的检测方法能够同时准确检测yk-009中的多种有关物质，灵敏度高，准确度高，重现性高，耐用性好，便于对yk-009中有关物质进行准确检测和质量监控。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种阳离子脂质yk-009中有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、（1）将待测样品与稀释剂混合，得到供试品溶液；

5、（2）将有关物质标准品与稀释剂混合，得到对照品溶液；

6、（3）将供试品溶液、对照品溶液进行液相色谱检测，根据检测结果计算有关物质含量；所述液相色谱检测的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为乙酸-三乙胺的水溶液，所述流动相b为乙酸-三乙胺的乙腈溶液。

7、步骤（1）、（2）不区分先后顺序。

8、所述有关物质包括杂质1-杂质10中任意一种或至少两种的组合：

9、杂质1；

10、杂质2；

11、杂质3；

12、杂质4；

13、杂质5；

14、杂质6；

15、杂质7；

16、杂质8；

17、杂质9；

18、杂质10。

19、上述方法能够同时准确检测yk-009中的多种有关物质，灵敏度高，准确度高，重现性高，耐用性好，便于对yk-009中有关物质进行准确检测和质量监控。

20、优选地，所述稀释剂包括甲醇和/或乙腈，优选乙腈。

21、优选地，步骤（3）所述液相色谱检测的流动相包括流动相a和流动相b；

22、所述流动相a为乙酸-三乙胺的水溶液，所述流动相b为乙酸-三乙胺的乙腈溶液。

23、优选地，所述流动相a由乙酸-三乙胺水溶液与水混合配制得到，所述流动相b由乙酸-三乙胺水溶液与乙腈混合配制得到；

24、所述配制流动相a和流动相b中的乙酸-三乙胺水溶液中，三乙胺与水的体积比独立地为(1-3):(17-19)，ph独立地为6.5-7.5，优选7.0，其中三乙胺的份数可以是1、1.5、2、2.5或3等，水的份数可以是17、17.5、18、18.5或19等，ph可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

25、优选地，所述流动相a和流动相b中乙酸-三乙胺水溶液的浓度独立地为0.8-1.2%，例如0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选1%。

26、优选地，步骤（3）所述液相色谱检测采用梯度洗脱方式进行，具体洗脱梯度如下：

27、第0-15 min，流动相a的体积分数为23-27%，其余为流动相b；

28、第15-30 min，流动相a的体积分数由23-27%匀速变为4-6%，其余为流动相b；

29、第30-40 min，流动相a的体积分数为4-6%，其余为流动相b；

30、第40-41 min，流动相a的体积分数由4-6%匀速变为0，其余为流动相b；

31、第41-45 min，流动相a的体积分数为0，其余为流动相b；

32、第45-45.1 min，流动相a的体积分数由0匀速变为23-27%，其余为流动相b；

33、第45.1 min以后，流动相a的体积分数为23-27%，其余为流动相b。

34、优选地，步骤（3）所述液相色谱检测中，固定相为己基连接的苯基键合硅胶。

35、优选地，步骤（3）所述液相色谱检测中，色谱柱温度为20-50℃，优选40℃，流动相流速为0.2-0.4 ml/min，优选0.2 ml/min，进样量为2-10 μl，优选5 μl；其中色谱柱温度可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等，流动相流速可以是0.2 ml/min、0.25 ml/min、0.3 ml/min、0.35 ml/min或0.4 ml/min等，进样量可以是2 μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl或10μl等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

36、优选地，所述有关物质包括杂质1-杂质10。

37、上述特定参数和试剂原料能够有效提高检测的灵敏度和准确度。

38、另一方面，本发明还提供了如上所述的阳离子脂质yk-009中有关物质的检测方法在阳离子脂质yk-009质量控制中的应用。

39、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

40、本发明提供了一种可同时分离并检测阳离子脂质yk-009中多种有关物质的方法，其中，杂质3（副产物生成杂质）和杂质6（工艺杂质）与主峰分离度为2.72，其余杂质与主峰之间分离度均＞2.72，显著优于分离度标准（＞1.5），峰形明显，能实现yk-009与10种杂质的分离，分离度良好。现有技术中未记载yk-009中相关物质的检测方法，但该方法实现了对yk-009中杂质进行有效分离和检测，有利于yk-009的质量控制。

41、通过对条件的优化，改善yk-009及其杂质的峰形，使得各组分检测的灵敏度进一步得到提升。本发明方法采用的是电雾式检测器（cad）进行检测，基于检测器自身特点，采用主成分自身对照法对yk-009中有关物质进行定量计算，通过回收率试验，验证该法准确度良好，同时重现性高，耐用性好，便于对yk-009中有关物质进行准确检测和质量监控。