一种促进伤口愈合的水凝胶及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，涉及一种促进伤口愈合的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、大面积皮肤伤口、糖尿病伤口和皮肤烧伤等皮肤创口的治疗仍是伤口治疗中面临的一大挑战。皮肤愈合需经历止血、炎症、增殖、重塑一系列复杂阶段，其中炎症阶段是一个必要的自然阶段，如果时间过长，可能会形成慢性炎症伤口。而氧化应激又与炎症息息相关，因此，控制伤口微环境的氧化还原稳态对伤口愈合至关重要。

2、已有研究表明，多种植物来源的外泌体具有抗氧化、抗炎及促伤口愈合的作用。植物外泌体是一种磷脂双分子层结构的囊泡，主要成分是蛋白质、脂质、核酸等，可作为细胞间交流的信使调节多种生理和病理过程，其特征类似于哺乳动物外泌体，但具有更低的免疫原性以及大规模生产的潜力。然而，受限于靶向性差、易被清除的缺点，直接应用植物外泌体在伤口上效果并不理想。水凝胶因其能够填充不规则伤口、维持湿润环境、可调节机械性能以及良好的生物相容性而广泛应用于医用敷料领域。作为常用的药物递送系统，水凝胶可以实现药物的持续释放，减少临床环境中重复给药的需要。

3、基于此，本发明研发设计一款负载植物外泌体的新型水凝胶以促进伤口愈合。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种促进伤口愈合的水凝胶及其制备方法和应用，通过负载从香菜中提取的香菜外泌体，制备得到一种促进伤口愈合的新型水凝胶，有望成为在临床伤口治疗中更安全、经济的医用敷料。

2、本发明的技术方案是：

3、本发明提供了一种促进伤口愈合的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、通过梯度离心结合蔗糖密度梯度法从香菜中提取香菜外泌体，将香菜外泌体与海藻酸钠溶液按质量体积比0.5～2mg：1ml的比例混合，得到外泌体混悬液，然后将外泌体混悬液与氯化钙溶液按体积比0.5～2：1的比例混合，交联得到负载香菜外泌体的水凝胶。

5、进一步的，所述香菜外泌体与海藻酸钠溶液混合的质量体积比为1mg:1ml。

6、进一步的，所述外泌体混悬液与氯化钙溶液的体积比为1:1。

7、进一步的，所述海藻酸钠溶液由海藻酸钠溶于pbs得到，海藻酸钠溶液的浓度为1.5～2.5％(w/v)；所述氯化钙溶液由氯化钙溶于蒸馏水得到，氯化钙溶液的浓度为1.5～2.5％(w/v)。

8、优选的，所述海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)，所述氯化钙溶液的浓度为2％(w/v)。

9、本发明还提供了一种香菜外泌体的提取方法，包括以下步骤：

10、(1)将蒸馏水与香菜按质量比0.75～1.25：1的比例榨汁，得到香菜汁；

11、(2)将香菜汁依次进行梯度离心，取最终得到的上清液过滤得到滤液，梯度离心依次为：

12、第一次离心：4℃下，3000×g～3500×g离心20min～25min，

13、第二次离心：4℃下，9500×g～10000×g离心100min～120min；

14、(3)将滤液在4℃下，100000×g～120000×g离心1.5h～2h，弃上清，重悬沉淀于适量pbs(0.01m,ph＝7.4)得到重悬液；

15、(4)将重悬液转移至质量分数从上到下依次为8％、30％、45％、60％蔗糖密度梯度溶液，并在140000×g～160000×g下离心1.5h～2h，收集30-45％蔗糖层之间的悬浮液；

16、(5)将悬浮液加8～12倍体积的pbs后于4℃下，100000×g～120000×g离心45min～60min，弃上清，沉淀重悬于适量pbs(0.01m,ph＝7.4)后过滤，得到纯化后的香菜外泌体。

17、进一步的，步骤(3)和(5)中涉及到的适量pbs的体积以没过沉淀为宜。

18、进一步的，所述香菜外泌体提取方法的具体步骤为：

19、(1)将适量新鲜香菜去根、洗净、切碎后加入破壁机榨汁，再加入蒸馏水榨汁，纱布过滤得到香菜汁；所述蒸馏水与香菜的质量比为1:1；

20、(2)将香菜汁在4℃下3000×g、10000×g依次离心20min、120min，取最终得到的上清过0.45μm滤膜得到滤液；

21、(3)将滤液4℃下100000×g离心1.5h，弃上清，重悬沉淀于适量pbs(0.01m,ph＝7.4)得到重悬液；其中，所用pbs的体积以没过沉淀为宜；

22、(4)配制质量分数分别为8％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，将适量60％蔗糖溶液加入离心管底部，然后依次贴壁缓慢加入等体积的45％、30％、8％蔗糖溶液，要求溶液界面分明，将步骤(3)的重悬液转移至8％蔗糖溶液上层，并在150000×g下离心1.5h，离心后收集30-45％蔗糖层之间的悬浮液；

23、上述蔗糖溶液体积以大于等于步骤(3)的重悬液体积为宜。

24、(5)将悬浮液加10倍体积的pbs后，在4℃下，100000×g离心45min，弃上清，沉淀重悬于适量pbs(0.01m,ph＝7.4)后过0.22μm滤膜，得到纯化后的香菜外泌体；其中，所加的适量pbs体积以没过沉淀为宜。

25、本发明还提供了采用上述任一项所述的制备方法制得的负载香菜外泌体的水凝胶。

26、本发明还提供了上述所述的负载香菜外泌体的水凝胶和/或上述任一项制备方法制得的负载香菜外泌体的水凝胶在制备促伤口愈合的药物中的应用。

27、本发明又提供了一种促进伤口愈合的药物，包括任一项所述制备方法制得的负载香菜外泌体的水凝胶和/或所述的负载香菜外泌体的水凝胶。

28、进一步的，所述药物中还包括药学上可接受的敷料。

29、本发明的有益效果：

30、(1)本发明提供的负载香菜外泌体的新型水凝胶，具有良好的黏弹性和生物相容性，可作为敷料应用在皮肤伤口表面；同时，该水凝胶具有香菜外泌体缓释效果，延长了外泌体的释放时间，使其更好发挥生物功能；通过缓释香菜外泌体，该水凝胶能够缓解伤口氧化应激与炎症，促进伤口修复。

31、(2)本发明水凝胶负载的香菜外泌体呈典型的茶托状双层膜结构，粒径在150nm左右，提取得到的香菜外泌体中每毫升有2.11×1011个外泌体颗粒，且能被皮肤细胞摄入，具有促细胞迁移、抗氧化、抗炎功效，能有效促进皮肤伤口愈合；本发明提供的香菜外泌体的提取方法，能够得到较高的产量和纯度。

1.一种促进伤口愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述香菜外泌体与海藻酸钠溶液混合的质量体积比为1mg:1ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体混悬液与氯化钙溶液的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液由海藻酸钠溶于pbs得到，海藻酸钠溶液的浓度为1.5～2.5％(w/v)；所述氯化钙溶液由氯化钙溶于蒸馏水得到，氯化钙溶液的浓度为1.5～2.5％(w/v)。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述香菜外泌体的提取，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的负载香菜外泌体的水凝胶。

8.权利要求7所述的负载香菜外泌体的水凝胶和/或权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的负载香菜外泌体的水凝胶在制备促伤口愈合的药物中的应用。

9.一种促进伤口愈合的药物，包括权利要求1-6任一项所述制备方法制得的负载香菜外泌体的水凝胶和/或权利要求7所述的负载香菜外泌体的水凝胶。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的敷料。