提高鹅膏蕈毒素-抗体缀合物的治疗指数的方法与流程

发明领域本技术涉及癌症免疫疗法领域。特别地，本技术涉及用于治疗患者的癌症以增加基于鹅膏蕈毒素(amatoxin)的抗体-药物缀合物的治疗指数的给药方案。本技术还涉及用于此类治疗方案的基于鹅膏蕈毒素的抗体-药物缀合物。

背景技术：

0、背景

1、目前批准的抗体-药物缀合物(adc)诸如enhertu(her2)、trodelvy(trop-2)和blenrep(bcma)仅基于少数细胞毒性机制，主要以微管或dna靶向毒素作为有效载荷。鹅膏蕈毒素是一组熟知的毒素，其由天然存在于鹅膏属(amanita)担子菌纲(basidiomycetes)蘑菇中的九种结构相关的毒素组成。最突出的成员是四十多年前在绿色死亡帽蘑菇鬼笔鹅膏(amanita phalloides)中鉴定的α-鹅膏蕈碱和β-鹅膏蕈碱。鹅膏蕈毒素为公众所熟知，并且由于其在蘑菇摄入后的毒性作用而在保健和医学科学中得到了深入研究。它们是全世界95％的所有致命蘑菇中毒的原因。鹅膏蕈毒素是高度耐热的，耐酶和酸降解，并且在水中示出优异的溶解度。特别是α-鹅膏蕈碱已被证明是鬼笔鹅膏(a.phalloides)中毒后观察到的严重肝脏和肾脏损伤的主要原因。在肝脏中，它被位于肝细胞上的特定转运蛋白(有机阴离子转运多肽(oatp1b3))吸收，导致其细胞溶解。

2、由于其亲水性质，鹅膏蕈碱不会被动地穿透细胞，并且对于除肝细胞之外的大部分其他人类细胞类型没有示出或仅示出差的摄取。然而，据报道，除肝脏外，其他器官，主要是肾脏，也受到影响。由于鹅膏蕈毒素不会被进一步代谢，它们在摄入后的最初几天内主要通过肾脏和尿液排出，导致严重的肾毒性。

3、鹅膏蕈毒素是双环八肽，包含三种独特的氨基酸：二羟基-异亮氨酸、羟基-色氨酸和羟基-脯氨酸。它们以最高亲和力与真核生物rna聚合酶ii结合，导致转录和蛋白质合成显著降低1000倍以上。羟基化侧链的oh基团负责分子的高亲水性，并且在一定程度上负责其与rna聚合酶ii的接合。由于这种高度特异性抑制，鹅膏蕈碱已被广泛用作研究基因表达和转录调控的工具。

4、重要的是，鹅膏蕈碱诱导的影响不限于分裂细胞，并且也在静息(非分裂)细胞中起作用，这与目前在大多数批准的adc中使用的靶向dna或微管蛋白的毒素不同。

5、通过这种新的作用模型，基于鹅膏蕈碱的adc因此与市售adc相比具有几个优点：首先，基于鹅膏蕈碱的adc也影响非增殖和静止细胞。其次，鹅膏蕈碱不是外排转运蛋白的已知底物。因此，基于鹅膏蕈碱的adc在对其他线疗法有抗性的肿瘤中也是有效的。第三，没有已知的鹅膏蕈碱作为adc有效载荷的抗性机制，这可能是由于真核细胞中rna聚合酶ii的严格结构-活性要求，真核细胞几乎不为rna聚合酶ii中的逃逸突变提供空间。

6、鹅膏蕈毒素基于其物理化学性质非常适合用作adc的有效载荷：首先，鹅膏蕈毒素允许接头的附接而不降低其细胞毒性潜力，其次，鹅膏蕈毒素具有高细胞毒性潜力以在低浓度实现细胞杀伤，并且第三，当与抗体偶联时，鹅膏蕈毒素仅在细胞内展现其细胞毒性潜力。

7、除了其有希望的功效概况外，鹅膏蕈碱还示出一些有利的物理化学性质。与通常用作adc有效载荷(弹头(warhead))的所有其他毒素相比，该分子是非常亲水性的。这有利于在水性缓冲液中的缀合并防止adc聚集，这使得其易于处理并降低其免疫原性的潜力。还表明，鹅膏蕈碱是启动多药耐药性(mdr)过程的非常差的底物，并且鹅膏蕈碱缀合物在表达mdr的肿瘤细胞中是高度有效的。

8、鹅膏蕈碱在血浆中高度稳定，并且由于其低分子量和亲水性，它经由肾脏非常迅速地清除，这使得它不太可能在其他组织中积累。另一个安全特征是其不能经由被动摄取进入正常细胞。与鹅膏蕈碱缀合的抗体相比，游离毒素示出20,000倍降低的细胞毒性。当与抗体缀合时，鹅膏蕈碱或鹅膏蕈毒素不再是oatp1b3介导的细胞摄取的底物，这尤其降低了肝毒性，然而，在动物模型中可以观察到一些肝毒性，如通过施用基于鹅膏蕈碱的adc后肝酶诸如alt、ast或ldh的瞬时增加所证明的，这缩小了此类基于鹅膏蕈碱的adc的治疗窗口。因此，仍然存在进一步改进耐受性并由此提高基于鹅膏蕈毒素的adc的治疗指数或治疗窗口的持续的医学需求。

技术实现思路

0、发明概述

1、如本技术中所示，发明人意外地发现，通过在施用治疗剂量的第二基于鹅膏蕈毒素的adc之前施用第一亚治疗剂量的第一基于鹅膏蕈毒素的adc，可以进一步降低第二基于鹅膏蕈毒素的adc的肝毒性，导致第二基于鹅膏蕈毒素的adc的治疗指数增加。发明人另外令人惊讶地发现，如果第一基于鹅膏蕈毒素的adc和第二基于鹅膏蕈毒素的adc确实结合不同的靶蛋白，也可以实现这种效果，如通过使用针对本发明方法的所述第一adc的非结合抗体所证明的。

2、因此，本发明的一个目的是提供一种提高抗体-药物缀合物的治疗指数的方法，其中本发明的方法包括向患者施用第一剂量的第一抗体-药物缀合物的步骤，其中所述第一剂量的所述第一抗体-药物缀合物在施用第二剂量的抗体-药物缀合物之前约30天至约15天之间施用，并且其中所述抗体-药物缀合物具有以下结构：

3、ab-(z-l-ama)n，

4、其中抗体或其抗原结合片段(ab)通过化学部分(z)缀合(共价连接)至接头(l)、缀合至鹅膏蕈毒素部分(ama)，并且n为约1、2、3、4至约5、6、7、8。

5、本发明还提供了如本文公开的第一和/或第二基于鹅膏蕈毒素的adc，用于在本发明的提高所述第二基于鹅膏蕈毒素的adc的治疗指数的方法中使用，其中第一基于鹅膏蕈毒素的adc和第二基于鹅膏蕈毒素的adc可以相同，或者可以彼此不同。

6、附图描述

7、图1各种鹅膏蕈毒素的结构式。粗体数字(1至8)表示形成鹅膏蕈毒素的八种氨基酸的标准编号。还示出了氨基酸1、3和4中原子的标准名称(分别为希腊字母α至γ、希腊字母α至δ和数字1’至7’)。

8、图2(a)在有和没有基于鹅膏蕈毒素的adc预处理的cb17-scid小鼠中的研究的实验研究设计。(b)使用不同剂量的抗dig鹅膏蕈毒素-adc进行3只(上图)或5只(下图)小鼠/组的两个独立实验。描绘了在肝脏中具有肉眼可见变化的小鼠数量以及存活率；由于自溶状态，不能检查所有小鼠的肝脏异常。使用gehan-breslow-wiloxon检验计算p值。

9、图3重复给药减少食蟹猴中鹅膏蕈毒素-adc诱导的器官损伤。(a)将鹅膏蕈毒素-adc的最大耐受剂量(mtd)的单剂量毒性(左)与作为剂量递增方案的最后步骤给予相同剂量后发生的毒性进行比较的实验设置。(b)在用鹅膏蕈毒素-adc i.v.处理后食蟹猴的血清中的天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)和乳酸脱氢酶(ldh)水平，鹅膏蕈毒素-adc作为单剂量(圆形)或作为剂量递增方案的最后步骤(三角形)给予。虚线：未经处理的动物的基线水平。示出了三次生物重复的平均值与sem。p值：welch t检验；*：p≤0.05。(c)比较不同轮处理后给予鹅膏蕈毒素-adc的mtd毒性的实验设置。(d)在用鹅膏蕈毒素-adc的mtd i.v.处理后食蟹猴的血清中的ast、alt和ldh水平，鹅膏蕈毒素-adc以第一轮(三角形)、第二轮(空心圆形)、第三轮(空心三角形)或第四轮(多边形)处理给予。描绘了三个生物重复的平均值与sem。

10、图4用基于鹅膏蕈毒素的抗psma adc的重复给药提高了s.c.lncap cdx模型中的抗肿瘤功效。(a)在s.c.人类前列腺腺癌lncap cdx模型中比较基于鹅膏蕈毒素的抗psmaadc的单剂量与多剂量(每周一次，持续4周，q7dx4)处理的体内功效研究的实验设置；(b)s.c.lncap肿瘤的肿瘤生长，通过卡尺测量持续84天(n＝18只动物/组)，三角形：单剂量处理，正方形：多剂量处理，实心圆形：pbs对照。示出了平均值与sd。p值：通过holm-sídák方法进行多重检验校正的welch t检验；从第21天至第56天具有统计学意义。**p<0.01；(c)用单剂量(三角形)或多剂量(正方形)的基于鹅膏蕈毒素的抗psmaadc处理的携带lncap s.c.肿瘤的小鼠的存活概率；圆形：pbs对照。p值：gehan-breslow-wiloxon检验；****：p<0.001。