一种亲水性脂肪来源脱细胞基质支架及其制备方法和应用

本发明属于生物材料，具体涉及一种亲水性脂肪来源脱细胞基质支架及其制备方法和应用。

背景技术：

1、脂肪源性脱细胞基质(decellular adipose-derived matrix,dam)生物支架可以在体内实现脂肪组织再生并用于软组织重建，有广阔的临床应用前景。自2010年flynn提出经典的dam制备方法以来，已有十多种改良和优化方法的报道，但各方法主要存在以下问题：

2、1、制备的优化缺乏针对性。所有的制备过程都包括破碎细胞、去除细胞成分、去除脂质成分几个步骤。没有以保留某种有益成分为目的而设计的具有针对性的优化方法。

3、2、制备成本高。经典的脱细胞方法需要各种生物酶(胰蛋白酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、脂肪酶)等。虽然极大的缩短了脱细胞总耗时，但酶的成本很高，而且酶来源于牛、羊等，增加了引入异种抗原的风险。

4、3、制备过程繁琐、耗时。经典的脱细胞方法需要109个小时，多种洗涤试剂和酶反复重复使用，步骤繁琐。长时间的漂洗会导致有益成分的流失，并破坏支架的物理结构。各种优化方法中，无酶法省略了酶的使用，且一定程度上缩短了制备时间，但也均需要三天以上的时间。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明提供了一种亲水性脂肪来源脱细胞基质支架及其制备方法和应用。本发明在保留dam中有益成分，即亲水性成分的基础上，提出了一种新的基于无酶法进行脱细胞的技术方案。

2、本发明所提供的技术方案如下：

3、一种亲水性脂肪来源脱细胞基质支架的制备方法，包括以下步骤：

4、1)从物理破碎后的脂肪组织中获取亲水性脂肪源性脱细胞基质前体；

5、2)采用曲拉通x-100(tritonx-100)溶液对亲水性脂肪源性脱细胞基质前体进行化学漂洗，得到上清液和沉淀；

6、3)分离出步骤2)得到的沉淀，并进行超纯水洗涤，收集沉淀，得到亲水性脂肪来源脱细胞基质支架。

7、上述技术方案中：

8、通过蛋白质谱分析可知，采用triton行化学漂洗，较无酶法在第一步采用nacl水溶液漂洗相比，可保留更多的蛋白成分；

9、其次，将长时间的水漂洗设置在最后一步，此时dam的亲水性蛋白已缠绕成絮，不溶于水，使用水进行漂洗不会损失亲水性的有益蛋白；

10、最后，由于为亲水性蛋白，不含脂质成分，该技术方案可以省略异丙醇脱脂的步骤。

11、这是该流程制备的支架具有优越成脂效果的根本原因。

12、具体的，步骤1)中：所述脂肪组织为废弃的吸脂脂肪组织。

13、基于上述技术方案，可以对废弃的吸脂脂肪组织进行利用。

14、具体的，步骤1)中，所述亲水性脂肪源性脱细胞基质前体为：从物理破碎形成的脂肪浆液中分离出油和亲脂性成分所得到的亲水性成分。

15、可以采用现有的基于对亲水性和亲油性成分的分离原理的手段分离出亲水性成分，也可以采用如下方法：

16、1、支架供体的准备：

17、从临床收集废弃的吸脂脂肪组织200ml作为供体。将其中粗大的纤维组织、筋膜等挑出后，分装于50ml离心管，每管25ml脂肪组织，加入25mlpbs浸泡、上下颠倒5次摇匀，低速离心(500g，2min)，去除油脂、血液、肿胀液等，保留中间的脂肪层。pbs洗涤重复三遍。

18、2、物理破碎：

19、收集洗涤后的脂肪组织，再次离心以尽可能去除水分。匀浆机(fj200-sh,huxiltd.,shanghai,china)高速搅拌(20,000r/min)2分钟，直至完全成液体，没有肉眼可见的颗粒状成分。

20、3、亲水性和亲脂性成分的分离：将每50ml物理破碎后的脂肪液体高速离心(3500g，3min)，取沉淀即为亲水性dam前体成分，可得到亲水性dam前体的体积为3.5ml。

21、具体的，步骤2)包括以下步骤：

22、2a)在离心管中加入亲水性脂肪源性脱细胞基质前体和tritonx-100溶液；

23、2b)摇床上震荡；

24、2c)高速离心，去除上清液，向沉淀部分加入新的tritonx-100溶液；或者，通过滤网将液体成分过滤，向收集的固体成分中加入新的tritonx-100溶液；

25、2d)再重复步骤2b)至2c)两次至少两次，得到上清液和沉淀。

26、具体的，步骤2a)中，tritonx-100溶液的体积浓度为0.8～1.2％；亲水性脂肪源性脱细胞基质前体与tritonx-100溶液的体积比为1:(9～11)。

27、具体的，步骤2b)中，操作温度为36～38℃；操作时间为4.5～5.5小时。

28、具体的，步骤2c)中，高速离心的离心力为3400～3600g，时间为2.5～3.5min；新的tritonx-100溶液的体积浓度为0.8～1.2％。

29、具体的，步骤2c)中，再重复步骤2b)至2c)两次，得到上清液和沉淀。

30、具体的，步骤3)包括以下步骤：

31、3a)高速离心去除上清液，向沉淀中加入超纯水，摇床上震荡；或者，通过滤网将液体成分过滤，向收集的固体成分中加入新的超纯水；

32、3b)高速离心去除上清液，向沉淀中第二次加入超纯水，摇床上震荡；

33、3c)高速离心去除上清液，向沉淀中第三次加入超纯水，摇床上震荡；

34、3d)离心，收集沉淀，得到亲水性脂肪来源脱细胞基质支架。

35、具体的，步骤3a)中，亲水性脂肪源性脱细胞基质前体与超纯水的体积比为1:(9～11)；摇床震荡的温度为36～38℃，时间为0.4～0.6小时。

36、具体的，步骤3b)中，亲水性脂肪源性脱细胞基质前体与超纯水的体积比为1:(9～11)；摇床震荡的温度为36～38℃，时间为6～9小时。

37、具体的，步骤3c)中，亲水性脂肪源性脱细胞基质前体与超纯水的体积比为1:(9～11)；摇床震荡的温度为36～38℃，时间为0.4～0.6小时。

38、本发明还提供了根据上述方案制备得到的亲水性脂肪来源脱细胞基质支架。

39、具体的，亲水性脂肪来源脱细胞基质支架中bfgf、vegf、cxcl12和ccl21四种关键细胞因子的含量总量大于1ng/ml。

40、本发明还提供了亲水性脂肪来源脱细胞基质支架的应用，用于制备脂肪再生生物支架。

41、本发明的有益效果如下：

42、1、提供了适合亲水性dam的制备步骤，有效提高了支架的成脂效果(参考图3)。

43、2、降低了制备成本，整个过程仅使用1％稀释程度的tritonx-100溶液，与经典的使用酶的方法相比成本大大降低。

44、3、简化了流程，整个制备的漂洗流程仅需25小时。短时间的漂洗保证了dna的有效去除(参考图5)，同时保留了更多的有益成分，如生长因子(参考图6)。