一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法及应用

本发明涉及生物医用材料，尤其涉及一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法及应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是一组具有脂质双分子层结构的膜性囊泡，是由各种细胞自发或是在一定条件下释放出来的一种亚细胞成分，根据其结构、大小、来源可分为小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sevs)、微囊泡(microvesicles，mvs)、凋亡小体(apoptotic bodies，abs)、癌小体。sevs现存于各种真核细胞和生物体液中，包括血液，唾液，尿液，脑脊液和细胞培养液中。它们在细胞间信号传导和细胞通讯等过程中起着关键作用，并且参与多种生物学过程。

2、sevs具有生物相容性好，免疫原性低等优势。随着研究的深入，天然sevs的缺陷也逐渐暴露。①天然sevs靶向性差：成熟sevs被供体细胞排出进入体液循环，循环过程中部分sevs被体内其他细胞摄入而无法全部精准达到需要治疗的区域；②有效的天然sevs数量过少：细胞产生的sevs全部进入体液循环导致细胞摄入的sevs不全都具有治疗作用；③负载分子含量无法达到治疗浓度：sevs在供体细胞中加工组装，继承了供体细胞的生物活性物质，导致sevs负载的治疗所需物质含量占比低。因此，研究者开始人工制备特殊的sevs——工程化sevs来达到治疗目的。

3、工程化修饰sevs使其具有靶向功能的研究已初步应用于多个领域，但是关于sevs的骨靶向修饰的研究较少。cui等人提取人类间充质干细胞msc分泌的sevs，以靶向成骨细胞的sevs递送人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白的小干扰片段si-shn3(bt-exo-sishn3)，骨靶向肽的工程化修饰赋予了bt-exo-sishn3将si-rna特异性递送至成骨细胞的能力，从而达到了精准治疗骨质疏松的目的。luo研究表明，骨髓基质细胞的sevs(stexos)在体外可显著增强骨髓间充质干细胞(bmsc)的成骨细胞分化。然而，将stexos注射至骨质疏松症小鼠模型，无法改善骨质疏松症，主要是stexos主要积聚在肝脏和肺部，而不是骨骼中。因此，他们将stexos表面与bmsc特异性适体结合，从而增强其在骨靶向的作用。

4、但目前研究使用的sevs多由特定细胞分泌收集而来，如多种肿瘤细胞、不同来源的间充质干细胞、未成熟的树突状细胞等，其供体细胞产量较低、收集成本高且费时费力，间充质干细胞来源的sevs目前还被证实存在一定的生物毒性。

5、因此，提供一种获得性强、成本低、毒性低能够达到精准的促成骨作用且更经济有效的工程化修饰的sevs的制备方法在骨修复方面具有重要的研究意义和应用价值。

技术实现思路

1、本发明提供一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法及应用，以解决上述问题。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

3、本发明一方面提供了一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

4、s1：新鲜的脱脂牛乳通过差速超速离心获得牛乳细胞外囊泡；

5、s2：配制1mg/ml的磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽的储存液；

6、s3：将所述牛乳细胞外囊泡与所述磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽储存液混合，将获得的混合液孵育过夜；

7、s4：对所述混合液离心、重悬、收集，得到成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡sdssd-sev。

8、进一步地，所述牛乳细胞外囊泡与所述磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽储存液混合的体积比为9：1。

9、进一步地，s1的具体步骤包括以下步骤：

10、s11：将新鲜的脱脂牛乳在4℃，13000g离心0.5h，收集中层乳清于600目-800目的滤网过滤，获得第一滤液；

11、s12：将第一滤液于4℃，100000g离心2h，收集中层乳清依次经具有0.22μm以及0.45μm滤膜的真空泵过滤，获得第二滤液；

12、s13：将第二滤液于4℃，135000g离心1.5h，对获得的沉淀使用pbs重悬，收集重悬液于0.22μm滤膜过滤，获得第三滤液；

13、s14：将第三滤液于4℃，100000g离心2h，对获得的沉淀使用1ml pbs重悬，收集悬液，获得牛乳细胞外囊泡milk-sev，-80℃储存。

14、进一步地，s2的具体步骤为：称取磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽dspe-peg-mal-cys-ser-asp-ser-ser-asp粉末0.001g，溶于1ml pbs中，配制成浓度为1mg/ml的储存液，-80℃储存。

15、进一步地，s4中对所述混合液离心、重悬、收集的具体步骤为：将所述混合液于4℃，135000g离心2h，对沉淀进行pbs重悬，收集得到成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡sdssd-sev。

16、本发明另一方面提供了所述的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法制备的成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡在骨修复中的应用。

17、本发明的有益效果是：

18、本发明中公开的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，以具有获得性强、成本低、毒性低优势的牛乳小细胞外囊泡作为来源，并使用磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽对其进行修饰，制备得到成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡，本方法通过工程化修饰牛乳小细胞外囊泡，能够在牛乳小细胞外囊泡的膜表面结合靶向成骨细胞的肽段，从而达到精准的促成骨作用，进而增强其骨修复的作用，在骨修复方面具有重要的研究意义和应用价值。

1.一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述牛乳细胞外囊泡与所述磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽储存液混合的体积比为9：1。

3.根据权利要求1所述的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，s1的具体步骤包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，s2的具体步骤为：称取磷脂聚乙二醇马来酰亚胺骨靶向肽dspe-peg-mal-cys-ser-asp-ser-ser-asp粉末0.001g，溶于1ml pbs中，配制成浓度为1mg/ml的储存液，-80℃储存。

5.根据权利要求1所述的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，s4中对所述混合液离心、重悬、收集的具体步骤为：将所述混合液于4℃，135000g离心2h，对沉淀进行pbs重悬，收集得到成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡sdssd-sev。

6.权利要求1所述的一种成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡的制备方法制备的成骨细胞靶向性工程化牛乳小细胞外囊泡在骨修复中的应用。