一种人参皂苷Rg3载药系统及其制备方法和应用

本发明属于人参皂苷rg3药物制备，特别涉及一种人参皂苷rg3载药系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是常见的消化道恶性肿瘤，是多种致病因素(如基因、饮食和环境)综合作用下形成的结直肠黏膜上皮和腺体部分发生的恶性肿瘤，在全球癌症发病率高，严重危害生命健康，其早期诊断率较低，大多数患者确诊时已是中晚期，部分已出现发生转移。

2、人参皂苷rg3(ginsenoside rg3，g-rg3)是从人参中提取的四环三萜皂苷，是抗癌新药“参一胶囊”的主要成分，本身具有良好的抗癌活性。g-rg3既可通过调控tme、提高机体免疫力以“扶正”，也可直接作用于肿瘤细胞发挥抑制增殖迁移、促凋亡作用以“解毒”，实现crc的多靶点多环节治疗。g-rg3作为人参中的四环三萜皂苷成分，其水溶性差、脂溶性弱、半衰期短，在壳核结构中的自组装的能力较难，口服后进入胃肠道内的被其中的酶或肠道细菌所代谢，且存在首过效应而血药浓度低，生物利用度仅为2.63％，因而大大限制了临床应用。

3、口服结肠靶向给药系统(oral colon-specific drug delivery system,ocdds)可使药物不在上消化道释放，而在回盲部或结肠释放，发挥局部或全身的治疗作用，常用于结肠部位疾病的治疗，如溃疡性结肠炎和结肠癌等，即有利于药物在病变部分蓄积，提高生物利用度，又能提高患者顺应性。

4、白及多糖(bletilla striata polysaccharides，bsps)是从兰科植物中药白及bletilla striata(thunb.)reichb.f干燥块茎中提取的一种水溶性多糖。bsps易溶于热水，微溶于冷水，不溶于乙醇。其单糖组成较为一致，大多是由甘露糖(mannose，man)和葡萄糖(glucose，glc)经1→4糖苷键键合而成两者，比例集中在4:1-2:1，分子量分布在1.0×104～1.0×105da之间。bsps本身具有止血、促进伤口愈合、保护消化道黏膜、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等多种药理活。作为一种天然高分子材料，bsps具有结构稳定、生物可降解、生物安全性高等特点，常被广泛用于医药原料和药用辅料，发挥“药辅合一”作用。由于bsps主链上含有大量活性羟基，易于结构改造，采用不同的设计策略对其结构母体进行修饰，可获得具有不同功能的载体材料。

5、bsps为亲水性高分子材料,通过引入疏水基团，如胆甾醇琥珀酸酯等可制备两亲性纳米载体，在水相中能够通过自组装形成具有核壳结构的纳米胶束体系，其疏水内核有利于包载难溶性抗肿瘤药物，提高药物生物利用度，并通过高渗透长滞留效应(enhancedpermeability and retention effect，epr)被动靶向肿瘤组织。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊及其制备方法。本发明制备的g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊，可以在结肠特定ph环境中降解，释放出g-rg3@bsps-sa聚合物胶束。bsps中大量暴露man分子分别与结肠癌细胞和m2-tams上高表达的man-r结合，以主动靶向的方式促进细胞摄取，在细胞内溶酶体环境中(ph5.0)释放药物，分别发挥其“扶正解毒”双重功效，提高了药物在结肠中的可利用度，发挥抗肿瘤作用，如图1所示。

2、人参皂苷rg3是具有“扶正解毒”功效的药物，由于其脂溶性弱，在壳核结构中的自组装的能力较难，因此本发明采用了乳化溶剂挥发法对制备工艺进行了改进。本发明采用乳化溶剂挥发法制备g-rg3@bsps-sa聚合胶束，并对其体外释药行为进行评价。将其装入结肠溶胶囊壳中，制备g-rg3@bsps-sa ocdds，并对其释药行为和初步稳定性进行考察。通过对肿瘤细胞和m2-tams的双靶向功能，实现对结肠癌“抑制肿瘤细胞生长、调控免疫微环境”的多环节调控作用，进而有效抑制结肠癌发生发展。

3、为了实现上述任务，本发明是通过以下技术方案得以实现：

4、一种g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊，其特征在于，由下述组分组成：人参皂苷rg3原料药、两亲性白及多糖聚合物载体、结肠溶胶囊壳。

5、两亲性白及多糖聚合物载体包括以下两种化合物：

6、(a)、白及多糖(bsps)，亲水性高分子材料。

7、(b)、硬脂酸(sa)，疏水基团。

8、上述g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊，采用水提醇沉法从中药白及中提取bsps，通过脱脂脱色、savag脱蛋白等步骤精制，得到白及粗多糖，经deae-52和sephadexg-200纯化得bsps。采用n(sa):n(dmap):n(edc)＝1:1:1.2比例进行合成bsps-sa聚合物。

9、上述g-rg3@bsps-sa聚合物纳米胶束，采用透析法制备bsps-sa聚合物胶束，经自组装得到澄清透明的高分子溶液，经tem观察胶束呈球形，且分布较为均匀；经malvern粒径分析仪测定粒径为145.12±8.54nm，pdi为0.18±0.012(pdi<0.3)，ζ电位为-23.3±0.031mv；7天内纳米胶束的粒径、分散指数和ζ电位无显著性差异(p>0.05)，bsps-sa聚合物纳米胶束稳定性良好，可用于后续载药。

10、上述g-rg3@bsps-sa聚合物纳米胶束，采用乳化溶剂挥发法制备后，其呈圆球形，粒径为185.43±1.34nm，pdi为0.21±0.01，ζ电位为-19.2±0.32mv，载药量为9.54±0.24％％，包封率为83.90±2.20％。在3种不同介质中(ph7.4、ph6.5、ph5.0)的48小时累积释放度分别是65.32±3.22％、79.56±4.28％、85.24±3.42％，释药速度明显大于游离g-rg3药物，在正常结肠液中较为稳定，在肿瘤酸性微环境下加速释放，入胞后有利于在溶酶体酸性环境下快速释药。

11、上述g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊在胃和小肠中均不释药，在模拟结肠液中48h药物累计释放量为63.54±3.12％，能够提高药物在结肠部位的蓄积。

12、上述g-rg3@bsps-sa聚合物纳米胶束，以coumarin-6作为荧光探针，采用荧光显微镜观察细胞摄取作用，coumarin-6@bsps-sa聚合物胶束经甘露糖受体介导入胞，ct-26细胞和m2-tams摄取率分别为游离coumarin-6的1.79倍、1.46倍。

13、上述g-rg3@bsps-sa聚合物纳米胶束中的bsps-sa载体，采用cck-8测定细胞毒性结果表明，bsps-sa载体对ct-26细胞和m2-tams的细胞活力均无明显影响，具有良好的生物安全性。。

14、上述g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊是指用于口服的双向结肠靶向药物。

15、上述g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：

16、(a)、bsps的提取：

17、将白及饮片放入60℃烘箱中充分干燥，粉碎过80目筛。取100g白及粗粉，加入20倍量的蒸馏水，90℃水浴锅中提取5小时，过滤，取残渣，重复提取3次。用尼龙纱布过滤，收集合并滤液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/3,加入3倍体积的无水乙醇，静置过夜以充分沉淀。收集沉淀，真空干燥，得到白及多糖提取物。

18、取适量白及多糖提取物，加入10倍体积石油醚，70℃条件下回流提取4h，过滤，取残渣。加入10倍量的80％乙醇，回流提取4h，过滤收集残渣。

19、在脱脂脱色后的多糖水溶液中，加入木瓜蛋白酶(0.5mg/ml)，用naoh溶液(1m)调节ph至7.0，置于50℃水浴中酶解2h，放入沸水浴灭酶10min，冷却至室温。采用sevag法除蛋白,将多糖溶液加至分液漏斗中，加入20％sevag试剂(三氯甲烷与正丁醇体积比为5：1)剧烈振摇20min，静置4h，弃去分层交界处的变性蛋白，重复操作不少于3次，直至分层交界处无明显浑浊为止。收集上层溶液，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3,加入3倍体积的无水乙醇，静置过夜以充分，收集沉淀，干燥后得到白及粗多糖(crude bletilla striatapolysaccharides，c-bsps)。

20、(b)、bsps的纯化：

21、称取200mg c-bsps，溶解于20ml去离子水中。用胶头滴管缓缓将白及多糖水溶液滴入deae-52纤维素柱(4cm×60cm)开展层析。依次用去离子水和0.1、0.2、0.5mol/l nacl溶液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，每5ml收集于1个试管中。

22、称取100mg经deae-52柱层析纯化后的白及粗多糖，溶于10ml去离子水，通过sephadexg-200葡聚糖凝胶柱(2.3cm×90cm)进行层析。用0.02mol/l的nacl水溶液层进行洗脱，流速为15ml/min，每5ml收集于1个试管中。

23、(c)、bsps-sa的制备：

24、分别称取142.24mg sa，61.08mg 4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，dmap)和93.14mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，edc)溶解于3ml dmso中，室温下磁力搅拌活化2h，得到活化反应液。称取400mg bsps溶于4ml dmso，逐滴加入到活化反应液中，于75℃反应4h，再于室温下反应24h。反应结束后将上述反应物装入透析袋(3500da)透析24h，除去dmso，用等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，以除去未反应的sa，40℃旋转蒸发以除去乙酸乙酯，将产物冷冻干燥，得到bsps-sa。

25、(d)、bsps-sa聚合物胶束的制备：

26、采用透析法制备bsps-sa聚合物胶束。精密称取25.0mg bsps-sa，加入5ml dmso完全溶解后，全部转移至透析袋中(8000da)，将透析袋置于500ml纯水中室温透析，每8h换一次水，累计透析48h，过0.45μm微孔滤膜，转移定容至25ml容量瓶中，得到空白聚合物胶束溶液。

27、(e)、g-rg3@bsps-sa聚合物纳米胶束的制备：

28、精密称取25mg的bsps-sa，加入4mldmso完全溶解后，全部转移至透析袋中(8-14kda)，将透析袋置于500ml纯水中室温透析，每8h换一次水，累计透析48h，过0.45μm微孔滤膜，转移定容至25ml容量瓶中，得到1mg/ml空白胶束溶液。精密称取5mg的g-rg3溶解于2.5ml甲醇中，得到2mg/ml g-rg3溶液。取1.6ml g-rg3溶液，以250rpm转速下逐滴滴入空白bsps-sa胶束中，室温下搅拌4h，挥去甲醇，过0.45um微孔滤膜，冷冻干燥，即得g-rg3@bsps-sa聚合物胶束冻干粉。

29、(f)、g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊的制备：

30、称取g-rg3@bsps-sa聚合物纳米胶束冻干粉适量，直接灌装于小鼠专用结肠溶胶囊(黄山胶囊有限公司提供)中，灌装后在囊帽与囊体接口处涂上胶液，晾干，即得。每粒胶囊中聚合物胶束粉末的装量为4mg，含g-rg3约为0.4mg。

31、本发明的有益之处在于：

32、本发明公开了一种人参皂苷rg3结肠溶胶囊及其制备方法，制备得到的g-rg3@bsps-sa结肠溶胶囊是一种口服双向结肠靶向制剂，人参皂苷rg3@bsps-sa ocdds可以经甘露糖受体介导，靶向m2-tams促进向m1型重编程，减少tgf-β、提高tnf-α，诱导cd8+t细胞浸润，逆转免疫抑制环境，重构肿瘤微环境以“扶正”；靶向结肠癌细胞抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，下调snail核转录因子的表达抑制上皮间质转化，抑制肿瘤生长而“解毒”，有效控制结肠癌发生发展。