一种食用型酿酒酵母胞内提取物的制备及其在抑制果蔬汁褐变方面的应用

本发明涉及鲜切果蔬的抑制褐变，具体涉及一种利用食用型酿酒酵母高密度发酵，高效生产胞内活性物质谷胱甘肽后，胞内提取物应用于抑制鲜切果蔬酶促褐变的方法。

背景技术：

1、酶促褐变(enzymatic browning,eb)是果蔬制品中常见的一种现象，尤其是在贮存、加工等过程中受到机械损伤后，与氧气充分接触更易发生褐变，主要表现为颜色暗沉。果蔬的酶促褐变主要是由于多酚氧化酶引起，多酚氧化酶与酚类底物反应形成邻醌类物质，醌类物质经过聚合而形成褐色物质，从而引起食物颜色发生变化，不仅影响果蔬的感官以及口感，同时对营养成分以及食用安全性造成损害。

2、目前常用的抑制鲜切果蔬褐变的手段主要是通过添加褐变抑制剂等，常用的褐变抑制剂如半胱氨酸、抗坏血酸、氯化钠等均为化学抑制剂且多为人工合成，存在潜在的食品安全风险。因此亟需寻找相对安全的天然酶促褐变抑制剂。

3、酵母提取物(ye)是一种天然、安全且易制备的食品添加剂，含有丰富的氨基酸、蛋白质、多肽等功能性物质，常被作为鲜味增强剂应用于食品添加行业，增加食品的呈香和味觉。谷胱甘肽是酵母提取物中的主要活性多肽，由半胱氨酸、甘氨酸以及谷氨酸缩合而形成的三肽，广泛存在于大多数动物、植物以及微生物中，是生物体内最重要的一种非蛋白巯基化合物。具有抗氧化、抗衰老、抑制酶促褐变等生理活性，而目前关于天然酵母提取物在食物防褐变方面的应用鲜有报道。

4、本发明，利用食用型酿酒酵母发酵gsh后的细胞提取物作为褐变抑制剂，对鲜切果蔬以及鲜榨果汁的酶促褐变抑制效果进行定性分析。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型抑制鲜切果蔬以及鲜榨果汁褐变的抑制剂，利用发酵罐高密度培养酿酒酵母，使其高效生产胞内活性物质谷胱甘肽，最终将食用型酿酒酵母胞内提取物应用到抑制食品褐变方面，以解决现有食品褐变抑制剂成分复杂不安全，抑制效果不理想的问题。

2、本发明的技术方案：

3、一种利用食用型酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的方法及其胞内提取物在食品褐变抑制方面的应用，其步骤如下：

4、(1)培养基制备

5、固体培养基成分为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。马铃薯去皮，切块煮沸30min，纱布过滤，加入葡萄糖和琼脂，融化后补足水至1000ml，121℃灭菌30min。

6、液体培养基成分为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、硫酸铵5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锌0.1g、蒸馏水1000ml。

7、发酵罐培养基成分为：葡萄糖900g、酵母膏220g、硫酸铵108g、磷酸二氢钾18g、硫酸镁3.6g、自来水18l。

8、补料培养基成分为：

9、(1)50％葡萄糖

10、(2)酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢铵、硫酸铵

11、(3)氨水

12、以上培养基均在121℃条件下，灭菌20min。

13、(2)酿酒酵母种子制备

14、菌种活化：

15、取保藏于超低温冰箱中的酿酒酵母甘油管常温化冻，一次性接种环挑取少量菌液，在平板上进行划线，30℃培养24h。

16、一级种子摇瓶培养：

17、从平板中挑取单菌落接种于装有50ml液体培养基的250ml摇瓶中，30℃，180rpm，培养23h左右。

18、二级种子摇瓶培养：

19、取10ml一级摇瓶种子液接种于装有500ml培养基的2l摇瓶中，30℃，180rpm，培养23h左右。

20、(3)酿酒酵母发酵罐培养

21、二级摇瓶发酵液2l接种至装有18l发酵培养基的50l发酵罐中，培养温度设置30℃，初始搅拌转速设置200rpm，ph设置为5.5。采用补料分批发酵方式进行培养，结合尾气质谱分析仪观察酿酒酵母生长状况。发酵过程中在酿酒酵母生长进入对数期，此阶段菌体快速生长，营养物质快速消耗，根据菌体生长速率以及碳源消耗速率计算碳源补加速率，保证营养成分供应充足，正常供给菌体生长，以及胞内产物积累。

22、发酵周期约48h左右，菌体湿重长至250g/l左右，单位干细胞中胞内产物谷胱甘肽积累量约7g/100g。

23、(4)酿酒酵母胞内谷胱甘肽提取

24、发酵液4000rpm离心10min后，菌泥加入少量的水重悬，进行抽滤，收集滤饼。取0.4g左右菌泥于50ml容量瓶中，0.01m hcl溶解后沸水浴10min，冷却至室温后，定容至50ml。通过0.45μm水系滤膜过滤后，通过液相检测其含量。

25、(5)酿酒酵母胞内谷胱甘肽含量的测定

26、胞内谷胱甘肽的测定通过使用高效液相进行分析鉴定，通过与标品比对进行定性，采用色谱峰面积归一法进行相对定量。

27、含量测定使用的仪器为安捷伦高效液相色谱仪。色谱条件为：

28、①色谱柱：c18，250nm×4.6nm，5μm；

29、②流动相：庚烷磺酸钠-磷酸盐缓冲溶液：甲醇＝90：10；

30、③检测波长：210nm；

31、④流量：1.0ml/min；

32、⑤进样量：20μl；

33、⑥柱温：35℃；

34、(6)鲜切蔬菜褐变抑制

35、土豆为常见的蔬菜且褐变现象较为明显，因此本发明采用土豆片进行酿酒酵母胞内谷胱甘肽抑制褐变验证，具体包含如下步骤：

36、新鲜土豆洗净去皮，使用切片机切片，尽量保证每片土豆片厚度以及表面积相同。对照组的土豆片浸泡于无菌水中，静置10min，实验组的土豆片浸泡于食用型酿酒酵母胞内谷胱甘肽提取液中，静置10min。将对照组以及实验组的土豆片放入无菌瓷盘中，置于4℃冰箱中冷藏，定时拍照记录颜色变化。

37、(7)鲜榨果汁褐变抑制

38、苹果汁为常见的鲜榨果汁且褐变迅速，为缓解苹果汁褐变迅速这一现象，本发明采用酿酒酵母胞内提取物抑制苹果汁褐变，具体包含如下步骤：

39、新鲜苹果洗净，去核，置于榨汁机中榨汁1-2min，将果渣与果汁分离，收集上清。鲜榨苹果汁与抑制剂的比例为3：1，将15ml鲜榨苹果汁与5ml酿酒酵母提取物混匀作为实验组，15ml鲜榨苹果汁与5ml无菌水混匀作为对照组。混匀后的溶液置于冰箱4℃中冷藏，定时拍照记录颜色变化。

40、(8)数据处理

41、颜色提取：

42、拍摄的照片通过颜色提取软件进行分析，计算红色(r)、绿色(g)、蓝色(b)、亮度(l)等值，对比颜色变化。以亮度(l)为指标表征褐变程度。

43、鲜榨果汁吸光度测定：

44、分别将不同处理方式的果汁在4000rpm条件下离心10min，分别取200μl上清于96孔板中，在420nm条件下测定果汁吸光度。

45、本发明提供了一种抑制鲜切果蔬、鲜榨果汁的新型抑制剂，具有以下优点：

46、1、本发明的新型植物褐变抑制剂还原型谷胱甘肽，来自食用型酿酒酵母，它是由食用型酿酒酵母通过发酵法生产的一种具有重要生理功能的活性三肽，安全无毒，可起到抗氧化、抗疲劳、清除自由基等功能，国标中目前未对其添加限量做出标准。

47、2、本发明的新型褐变抑制剂谷胱甘肽在抑制鲜切果蔬，鲜榨果汁褐变方面，抑制效果良好，且安全无害，在食品抑制方面未见报道。

48、3、本发明采用的新型食品褐变抑制剂来源于酿酒酵母发酵产生的胞内活性物质，发酵罐高密度培养酿酒酵母，通过发酵工艺优化提高胞内谷胱甘肽积累量，高效合成谷胱甘肽，降低食品褐变抑制剂的成本，同时增加食品褐变抑制剂的选择选项。

49、4、本发明加入了新型食品褐变抑制剂，鲜切果蔬以及鲜榨果汁的褐变现象明显减缓，改善了食品感官，延长了食品贮存周期，降低了商家成本。