具有经修饰的生物活性的白介素-2变体的制作方法

本发明涉及白介素-2(il-2)变体，其用于预防或治疗免疫病症，诸如但不限于急性或慢性炎性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥反应和癌症。本发明还涉及所述il-2变体用于筛选具有促(pro-)t效应细胞或促(pro-)t调节细胞活性的抗il-2抗体的用途。

背景技术：

1、白介素-2(il-2)是免疫应答的关键细胞因子，其促进t和b淋巴细胞(t和b细胞)的活化、增殖和存活。il-2受体(il-2r)是由α(il-2-ra或cd25)、β(il-2rb或cd122)和γ(il-2rg或γc或cd132)链组成的异三聚体蛋白质复合物。α链以低亲和力结合il-2并且不参与信号传导。β链和γ链的组合形成了在负责细胞介导的免疫响应的效应t细胞(常规t细胞(tconv；cd4+foxp3-))、cd8+和nk细胞上表达的中等亲和力受体；并且所有三个受体链形成在调节性t细胞(t调节细胞或treg；cd4+foxp3+)上组成型表达的高亲和力受体，其具有免疫抑制功能，并由活化的效应t细胞和nk细胞短暂或瞬时表达。

2、实际上，il-2是具有免疫刺激和抑制功能的细胞因子。因此，其已在临床中以高剂量刺激针对癌症的免疫响应，且最近以低剂量阻断各种病理生理学病症中的免疫响应，所述病理生理学病症包括自身免疫性疾病(诸如1型糖尿病(t1d))、自身免疫性血管炎、炎性疾病(诸如帕金森病)和寄生虫感染(诸如克氏锥虫感染)；和移植排斥反应，包括移植物抗宿主病(gvhd)(rosenberg et al.,sci.transl.med.,2012,4,127-；grinberg-bleyer,y.et al.,j.exp.med.,2010,207,1871–1878；tang et al.,immunity,2008,28,687-697；pilon et al.,am.j.transplant.,2014,14,2874–2882；saadoun et al.,n.engl.j.med.,2011,365,2067–2077；koreth et al.,n.engl.j.med.,2011,365,2055–2066；kennedy-nasser et al.,clin.cancer res.off.j.am.assoc.cancer res.,2014,20,2215–2225；baeyens et al.,diabetes,2013,62,3120–3131；gonzález et al.,brain.behav.immun.,2015,45,219–232；pérol et al.,immunol.lett.,2014,162,173–184。

3、但是，高剂量的il-2在癌症治疗中可能是毒性很强的，并且由于il-2对treg的有害作用，其功效不是最佳的(5-20％的应答者)。

4、在人类中，已成功施用低剂量的il-2以促进tregs并抑制自身免疫性血管炎患者和移植物抗宿主病的炎症(saadoun et al.；koreth,j.et al.；kennedy-nasser et al.)。但是，由于il-2的半衰期很短，需要重复施用，因此需要进行改进。

5、有趣的是，当il-2与抗il-2抗体(ab)复合时，il-2药效得到改进，其毒性降低，并且取决于ab，该复合物可以将il-2作用重定向至效应子(促teff抗il-2ab)或调控性(促treg抗il-2ab)免疫细胞，从而解决与基于il-2的疗法相关的主要问题(boyman et al.,science,2006,311,1924–1927.letourneau et al.,proc.natl.acad.sci.,2010,107,2171–2176)。关于作用机制，显示与促teff抗il-2抗体形成复合物直接阻断il-2与cd25的相互作用(levin et al.,nature,2012,484,529–533；rojas,g.in monoclonalantibodies(eds.ossipow,v.&fischer,n.)1131,447–476(humana press,2014))。

6、treg-定向的il-2/抗il-2复合物在不同的小鼠炎症模型中给出了令人印象深刻的结果：t1d、哮喘、eae、动脉粥样硬化、慢性肾病和移植，包括实体器官移植(webster etal.,j.exp.med.,2009,206,751–760；dinh,t.n.et al.,circulation,2012,126,1256–1266；polhill,t.et al.j.am.soc.nephrol.jasn,2012,23,1303–1308；satake et al.,plos one,2014,9,e92888；vokaer et al.,transplant.proc.,2012,44,2840–2844；goldstein et al.,front.immunol.,2013,4,155)。

7、另一种微调il-2生物活性的策略在于在il-2分子中进行点状突变以产生il-2变体或突变体il-2。已经公开了包含五个点状突变的突变体il-2蛋白(il-2超因子)，其赋予与野生型il-2相比对cd122高300倍的亲和力(levin et al.,nature,2012,484,529–533)。还公开了对il-2ra(cd25)具有更大亲和力和/或通过il-2rbg改变信号传导的免疫抑制性il-2变体(wo2010/085495和us2014/0286898)。

8、为了改进基于il-2的免疫治疗，需要用于预防或治疗免疫疾病的il-2变体。

技术实现思路

1、本发明人已经将人il-2的表面重构变体工程化并鉴定了能够优选刺激t-调节性(treg)细胞或拮抗il-2的il-2变体。

2、本技术的实施例显示了人il-2的表面重构变体(treg-激动剂变体)，其在体外优选刺激treg(图6)并在体内增加小鼠中的循环treg细胞(图10)。treg-激动剂变体可用于通过优选激活treg而间接降低免疫激活，进而反过来抑制免疫效应细胞。因此，本发明的treg-激动剂变体可用于治疗其中免疫调节或免疫抑制是有益的疾病，诸如但不限于过敏性和自身免疫性疾病，和包含免疫系统过度活化的疾病，其特别包括慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反应。

3、本技术的实施例还显示一些人il-2的表面重构变体是il-2拮抗剂(图9)。

4、在包括与过度产生il-2相关的免疫系统过度活化的疾病(特别包括慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反应)的情况下，根据本发明的il-2拮抗剂变体通过与内源性il-2竞争直接降低免疫活化，从而阻断il-2介导的免疫系统过度活化。

5、在急性gvhd的鼠模型中，本发明的il-2变体，无论是treg激动剂还是il-2拮抗剂，都可以控制gvhd并延迟临床gvhd发展。与测试的treg-激动剂变体相比，测试的il-2-拮抗剂变体在阻止体重减轻和优选增加循环人treg细胞方面更有效(图7和图8)。

6、此外，作为il-2拮抗剂的il-2变体通过将它们从野生型il-2信号传导中去除而在体外抑制treg分裂(类似于阻断抗il-2抗体；图12)。在体内，预期用本发明的il-2拮抗剂变体抑制treg将减少肿瘤生长，如先前用其它il-2拮抗剂所示(carmenate et al.,thejournal of immunology,2018,200,3475-3484)。根据本发明的il-2拮抗剂变体对treg的抑制将因此通过从treg抑制中释放免疫细胞来促进免疫响应(淋巴细胞(b、nk、cd4+或cd8+t细胞)；树突细胞(dc)；巨噬细胞等)。此外，取决于所用的il-2拮抗剂变体的剂量，cd8+t细胞功能被保留或适度地受影响(图9；图12)。因此，il-2拮抗剂变体进一步允许直接刺激cd8+t细胞免疫应答，例如针对肿瘤、病原体或疫苗。由于所有这些原因，用本发明的il-2-拮抗剂变体预期对癌症、感染剂和疫苗有更好的免疫应答。

7、总之，本技术中给出的结果表明，il-2拮抗剂变体在体内的作用可以根据免疫环境而变化，因为当免疫系统过度活化并产生过量的il-2时，其降低免疫活化(通过中和过量的内源性il-2)，而在不同的免疫环境中，其增加免疫活化(通过treg抑制和cd8+t细胞活化)。由于这些原因，il-2拮抗剂变体可用于治疗包括与过度产生il-2相关的免疫系统的过度活化的疾病，诸如但不限于慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反应，并且还用于治疗癌症和感染性疾病和增加对疫苗的免疫应答。

8、本发明人还解决了一些变体的晶体结构，这给出了对其作用机制的一些见解。本发明人观察到y31p取代(il2-v4)使il-2稳定在与il2-rα亚基复合物中观察到的构象相似的构象中(下文称为“α诱导构象”)。事实上，最近有一些来自鼠il-2的证据表明，tyr31所在的环ab中的构象变化会别构地影响与il-2rβ和γ亚基的相互作用(de paula et al.,p.n.a.s.,doi/10.1073；march 17,2020and spangler et al.,immunity,2015,42,815-825)。因而，很容易推测il2-v4活性背后的分子机制利用了这种别构回路。实际上，本发明人还获得了与il2-v4具有相同活性的il2-v1的结构。尽管该变体中存在的突变都不位于ab环中，但其也显示相同的“α诱导构象”。

9、不受理论的束缚，本发明人相信在本发明的il-2拮抗剂变体中引入的取代稳定了结合形式并诱导构象变化，所述构象变化别构地影响与il-2rβ和γ亚基的相互作用。

10、这些结果显示这些人il-2变体用于治疗免疫疾病和用于增加针对疫苗的免疫应答的潜力。特别地，免疫病症包括炎性疾病、过敏性疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)、移植排斥反应和癌症。疫苗可针对癌症或感染性疾病。

11、本发明人还显示il-2的表面重构变体也可用于筛选具有促teff或促treg活性的抗il-2抗体。

12、因此，本发明涉及能够优选刺激t-调节性细胞或拮抗il-2的白介素-2(il-2)变体，其在接触α受体的区域之外的il-2的表面位置包含至少一个氨基酸取代。

13、在一些实施方案中，根据本发明的白介素-2变体在选自下组的位置包含至少一个氨基酸取代：9、12、16、19、23、26、31、87、91和95，其中：

14、-第9和12位的氨基酸被d或e，优选e取代；

15、-第16、19、26、91和95位的氨基酸被k或r取代；优选地，第16和19位的氨基酸被r取代，并且第26、91和95位的氨基酸被k取代；

16、-第23位的氨基酸被e、q、t、n、g、a、v、l或i，优选l取代；

17、-第31位的氨基酸被p或n，优选p取代；

18、-第87位的氨基酸被m、v、e、d、t、c、n或q，优选n取代；并且

19、其中当所述取代在第91位时，则所述变体在第9、12、16、19、23、26、31、49、52、81、84、87、95、119、123、127、131或132位包含至少另一个取代，并且所指示的位置是通过与seqid no:1比对来确定的。

20、在一些优选实施方案中，根据本发明的变体在选自下组的位置包含一个或多个氨基酸取代：9、12、16、19、23、26、87、91和95，并且优选在选自下组的位置包含至少一个另外的取代：31、49、52、81、84、119、123、127、131和132，其中：

21、-第31位的氨基酸被p或n，优选p取代，并且，

22、-第49、52、84和132位的氨基酸被选自m、v、e、d、s、t、c、n和q的另一个氨基酸取代；优选地，第49位的氨基酸被q取代；第52和132位的氨基酸被s取代；并且第84位的氨基酸被n取代；

23、-第81位的氨基酸被d或e，优选e取代；

24、-第119、127和131位的氨基酸被k或r取代；优选地，第127位的氨基酸被k取代并且第131位的氨基酸被r取代；并且

25、-第123位的氨基酸被e、q、n、m、g、a、v、l或i，更优选a取代。

26、在一些其它的优选实施方案中，根据本发明的变体在第31位包含一个取代并且在第9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131和132位不包含任何取代。

27、在一些实施方案中，根据本发明的变体是人il-2变体，其优选选自下组：

28、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、n119k、t123a、和s127k的变体；

29、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、y31p、k49q、e52s、r81e、d84n、n119k、t123a、t131r和l132s的变体；

30、-包含取代y31p的变体，其中所述变体在第9、12、16、19、23、26、49、52、81、84、87、91、95、119、123、127、131和132位不包含任何取代；

31、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、y31p、k49q、e52s、r81e、d84n、t131r和l132s的变体；

32、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、y31p、n119k、t123a和s127k的变体；以及

33、-包含取代k9e、l12e、h16r、l19r、m23l、n26k、s87n、v91k、e95k、k49q、e52s、r81e、d84n、n119k、t123a、t131r和l132s的变体。

34、在一些实施方案中，根据本发明的变体与seq id no:1和3-8中的任一个具有至少70％的氨基酸同一性，并且优选地其在以下位置不包含任何取代：11、13、15、18、20、22、29、30、35、37、48、68、69、71、74、75、76、80、85、86、88、92、110、125、126、129、130和133。

35、在一些实施方案中，根据本发明的变体优选刺激t调节性细胞。

36、在一些实施方案中，根据本发明的变体是il-2拮抗剂，优选其中所述il-2拮抗剂抑制t调节性细胞并因此刺激免疫应答，特别是cd8+t细胞应答。

37、在一些实施方案中，根据本发明的变体以诸如分子复合物、颗粒、缀合物或融合蛋白的形式与目标试剂结合。在一些优选实施方案中，il-2变体与抗il-2抗体，优选与具有促t调节性细胞或促t效应细胞活性的抗il-2抗体复合。在一些优选实施方案中，il-2变体与针对treg特异性表面分子的抗体或其至少包含抗原结合位点的功能片段融合。针对treg特异性表面分子的抗体选自下组：抗ctla-4、抗cd25、抗ccr8、抗icos、抗ikzf2、抗cd70、抗garp、抗il1r1、抗cd39、抗ccr4和抗cd177抗体。

38、本发明涉及以可表达形式编码所述变体的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体，优选表达载体、以及包含该多核苷酸或载体的宿主细胞。

39、本发明涉及药物组合物，其包含作为活性物质的如本发明所公开的最终与目标试剂结合的il-2变体，根据本发明的多核苷酸、载体和/或细胞，以及至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体。

40、本发明涉及根据本发明的il-2变体、多核苷酸、载体和/或细胞用于治疗免疫病症的用途。

41、在一些实施方案中，根据本发明的优选刺激treg的il-2变体(treg-激动剂变体)、多核苷酸、载体和/或细胞用于离体或体内扩增treg以治疗其中免疫调节或免疫抑制是有益的疾病，诸如但不限于过敏性和自身免疫性疾病，和包含免疫系统过度活化的疾病，其特别包括慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反应。

42、在一些实施方案中，根据本发明的il-2拮抗剂变体、多核苷酸、载体和/或细胞用于阻断il-2介导的免疫系统过度活化，以治疗包含与过度产生il-2相关的免疫系统的过度活化的疾病，特别是慢性或急性炎性疾病、移植物抗宿主病(gvhd)和移植排斥反应。

43、在一些实施方案中，根据本发明的il-2拮抗剂变体、多核苷酸、载体和/或细胞用于抑制treg，并因此刺激免疫应答，包括b、nk、cd4+或cd8+t细胞、dc、巨噬细胞等，特别是cd8+t细胞免疫应答，用于治疗癌症或感染性疾病或增加针对疫苗，特别是针对癌症或感染性疾病的疫苗的免疫应答。

44、在一些实施方案中，根据本发明的il-2-拮抗剂变体、多核苷酸、载体和/或细胞与嵌合抗原受体t细胞疗法、免疫调节性单克隆抗体疗法或使用包括针对癌症和感染病的治疗剂和疫苗的抗癌剂或抗感染剂的疗法联合使用。在一些优选实施方案中，根据本发明的il-2拮抗剂变体、多核苷酸、载体和/或细胞与至少一种选自下组的另外的癌症疗法联合使用：靶向疗法、免疫疗法(诸如免疫检查点疗法和免疫检查点抑制剂)、共刺激抗体、化疗和/或放疗。

45、本发明还涉及根据本发明的il-2变体用于筛选具有促t效应细胞或促t调节性细胞活性的抗il-2抗体的用途。