一种猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法和应用

：本发明属于细胞生物学和再生医学，具体涉及一种猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法和应用。

背景技术

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背景技术：

1、由于再生医学和组织工程技术的发展结合了生命科学、工程学、计算机科学等多个学科的理论和方法，以及材料科学、细胞技术、基因工程技术等多项现代生物工程技术，为组织的再生和修复提供了新的手段和方法，能够修复、替代和增强人体内受损、病变或有缺陷的组织和器官。再生医学的关键组成部分：干细胞疗法，在医疗领域的应用非常广泛，部分产品管线已经进入临床阶段。干细胞具有强大的分化再生能力以及免疫调节作用，在成为再生医学中的研究热点的同时，也面对很多挑战，选择合适的细胞来源一直困扰着研究人员。

2、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是具有多向分化潜能和自我更新能力的多能干细胞，具有再生成各种组织、器官和细胞的潜力，相关临床研究已广泛开展，并取得了许多重大突破。子宫内膜间充质干细胞(endometrial mscs，简称emscs)是位于子宫内膜的功能层和基底层的细胞，在月经周期中负责子宫内膜的再生和重塑，具有多能分化潜能和自我更新的能力，能够分化为多种细胞类型，包括内皮细胞、平滑肌细胞和成骨细胞等。emscs在再生医学中显示出巨大的潜力，尤其是在治疗子宫内膜损伤和促进子宫内膜再生方面。研究表明，emscs能够通过分泌生长因子或外泌体来促进血管生成和基质细胞增殖，同时调节炎症反应并抑制纤维化子宫内膜的再生。在子宫内膜损伤的修复过程中，emscs能够迁移到受损部位，促进细胞增殖、血管生成、腺体形成以及上皮和基质成分的再生，从而改善子宫内膜的厚度和完整性。emscs还显示出对炎症反应的调节作用，能够降低促炎因子的表达，提高抗炎因子的表达，有助于创造更有利于胚胎植入的环境。此外，emscs在治疗子宫内膜粘连(asherman综合征)方面也显示出潜力。asherman综合征是一种由于感染或创伤导致的子宫内膜粘连形成，从而减少了胚胎植入的可用区域，导致不孕。emscs作为子宫内膜的本地细胞，对于周期性再生具有天然的优势，已成为修复受损子宫内膜的理想细胞来源。总的来说，emscs在子宫内膜修复和再生方面具有显著的潜力，为治疗子宫内膜相关疾病提供了新的策略和希望，并为临床应用提供新的治疗选择。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法的具体工艺过程包括以下步骤：

2、(1)获取组织

3、将新鲜的猪子宫(带卵巢)组织置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中保存；

4、(2)预处理组织

5、首先，在无菌室内，切开组织，使用预冷的添加有氯化镁和氯化钙的无菌pbs(ph＝7.4)浸泡，冲洗；

6、然后，剥离最外层的浆膜层，将猪子宫内膜层和肌层分开；

7、最后，将碎片化的内膜层，置于37℃的培养箱中用补充有消化酶的基础培养基消化2-3小时，每隔15分钟吹打一次，得到细胞悬浮液；

8、(3)初步离心

9、首先，通过100和40微米细胞滤器过滤细胞悬浮液，加入msc(间充质干细胞)完全培养基阻止进一步消化，用pbs清洗，1000rpm离心5分钟；

10、然后，用红细胞裂解液处理细胞2次，用pbs清洗；

11、最后，细胞以500cell/cm2的克隆密度接种在msc完全培养基中，在37.0℃下、5％co2的潮湿空气中孵育，细胞接种后的第二天，密切观察细胞的贴壁状况，每隔2-3天替换一次msc完全培养基，该细胞为p0代的细胞；

12、(4)培养与传代

13、首先，在细胞密度达到60％-80％时，将msc完全培养基、浓度为0.25％的胰蛋白酶和pbs提前置于37℃水浴锅中预热，吸除msc完全培养基，用pbs洗涤；

14、然后，加入胰蛋白酶消化，通过显微镜观察到细胞出现回缩、分散现象时，立即加入等量的msc完全培养基终止消化，将细胞移至ep管中，1000rpm离心5分钟；

15、最后，除去上清液，加入msc完全培养基重悬细胞，取1/3加入到新的培养皿里，轻摇混匀，置于co2培养箱中培养，12h后观察细胞状态，该细胞为p1代的细胞；

16、(5)计数、活性检测和培养

17、取100μl p1代的细胞，通过台盼蓝检测细胞活性并计数，调整细胞密度，接种至含msc完全培养基的六孔板中，置于细胞培养箱中培养，再次传代培养后的细胞为p2代的细胞，以此类推，其中，传代培养的细胞接种浓度为0.5×104/cm2-1.5×104/cm2；

18、(6)诱导分化

19、取p2-p3代的细胞加入不同的细胞诱导分化培养基，诱导其向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等分化。

20、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法的步骤(2)中的无菌pbs中添加的氯化镁和氯化钙的浓度分别为1mm和0.5mm；

21、消化酶中含有浓度为0.2％的ii型胶原酶和40μg/ml的i型脱氧核糖核酸酶(dnasei)，ii型胶原酶和dnase i联合使用，ii型胶原酶负责分解细胞外基质中的胶原蛋白，dnasei负责降解dna，减少细胞凝集，共同促进组织的有效消化，从而获得高质量的单细胞悬液；

22、其中，子宫内膜中大部分为子宫内膜细胞，间充质干细胞比例较小，ii型胶原酶通过水解细胞间质中的脯氨酸，分离细胞，对胶原的消化作用很强，对细胞间质也有较好的消化作用，但对细胞本身影响不大，能够使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害；

23、dnase i能够作用于细胞分离过程中降解出的dna，通过随机剪切dna链，将dna链消化成寡脱氧核苷酸，减少细胞团块，帮助制备单细胞悬液。

24、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法的步骤(3)和(4)中的msc完全培养基为含有10％胎牛血清(fbs)、1％双抗的msc基础培养基，其中，双抗为100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。

25、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法的步骤(5)中的细胞培养箱的培养条件是：温度37.0℃，5％ co2饱和度。

26、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞分离培养方法的步骤(6)中的细胞诱导分化包括成骨分化、成软骨分化、成脂肪分化等间充质干细胞三系诱导分化，且三系诱导分化(成脂诱导、成骨诱导、成软骨诱导)均是参照脂肪间充质干细胞成骨(guxmd-90021)，成脂(guxmd-90031)，成软骨(guxmd-90041)诱导分化试剂盒的步骤进行操作和验证钙结节、脂滴、软骨球切片的染色情况；其中，成骨分化培养基诱导子宫内膜间充质干细胞向骨细胞分化；成软骨分化培养基诱导子宫内膜间充质干细胞向软骨细胞分化；成脂肪分化培养基诱导子宫内膜间充质干细胞向脂肪细胞分化。

27、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞通过流式细胞仪进行表面标记物鉴定，确定适用于鉴定猪子宫内膜间充质干细胞的抗体：cd44(abcam，ab95138)，cd34(abcam，ab223930)，cd105(abcam，ab53321)，cd11b(abcam，ab34444)。

28、本发明涉及的猪子宫内膜间充质干细胞应用于宫腔粘连、皮肤及血管损伤等细胞的修复，包括修复卵巢早衰、子宫内膜损伤，修复方法简单易行，将其与生物材料复合植入病灶部位即可进行再生修复。

29、本发明与现有技术相比，从大动物：猪的子宫组织中进行分离，步骤简单、细胞获得量大，培养得到的子宫内膜间充质干细胞具有cd34－和cd11b－，且cd44+、cd105+的表型，在体外可经诱导分化为骨细胞、脂细胞、软骨细胞，能够修复多种组织器官损伤，应用实验研究和临床研究及应用，为细胞移植治疗提供了新的途径；其通过从猪子宫内膜组织来源分离间充质干细胞，并在含有细胞生长因子的培养基中培养和扩增子宫内膜间充质干细胞，诱导分化成多种细胞后，在组织工程和再生医学中具有广泛的应用前景。