一种获得丛枝菌根真菌根外菌丝的方法及其应用

本发明涉及真菌菌丝分离，具体地，涉及一种获得丛枝菌根真菌根外菌丝的方法及其应用。

背景技术：

1、丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，am)真菌可与陆地上72％以上的植物进行共生互作。am真菌不仅能够在植物根系皮层形成丛枝结构以及存在根内菌丝，也会在根外分布大量的根外菌丝。根外菌丝吸收土壤中的养分运输到根系内，从而增加植物的营养吸收。此外，大部分am真菌的根外菌丝生长迅速，能存活5个月之久(“lifespan andfunctionality of mycorrhizal fungal mycelium are uncoupled from host plantlifespan”)，可以作为am真菌的繁殖体(“colonization of roots by arbuscularmycorrhizal fungi using different sources of inoculum”)，从而使am真菌在新的宿主植物根系上定殖，形成新的丛枝菌根共生体。从土壤中分离收集am真菌的根外活体菌丝有利于丛枝菌根真菌繁殖体的多样化扩充。

2、菌根学研究中，本领域技术人员在探究丛枝菌根共生的内在机制以及进行丛枝菌根真菌的田间应用试验时，均需要使用大量的am真菌繁殖体。现有技术中通常采用直接对植物进行接种am真菌孢子进行扩繁，从而获得大量am真菌的孢子作为am真菌繁殖体，例如盆栽培养法、玻璃珠分室培养法、雾化培养法、无菌双重培养法等。这些方法都需要通过打碎植物根系或根际土壤，先用湿筛倾析来筛出孢子，然后用蔗糖溶液进行梯度离心分离出饱满的孢子，以获取植物根系和土壤中的孢子。其过程耗时长，且孢子在蔗糖中容易失活。与此同时，在分离孢子的过程中，容易损失土壤中的大量活体菌丝，从而造成am真菌繁殖体资源的浪费。此外，由于am真菌孢子的产出速率远远低于活体菌丝产出速率，直接分离am真菌活体菌丝更有助于am真菌的快速扩繁。然而分离am真菌活体菌丝的传统方法都比较粗放，需要反复的搅拌、离心以及抽滤过程(“external hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungiin pasture and tallgrass prairie communities”)，而且为了获得完整的活体菌丝，需要在体式显微镜下冰水浴中挑取菌丝，费时费力。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中缺少简易、高效且可视化分离收集土壤中am真菌根外活体菌丝的方法的问题，本发明提供了一种获得丛枝菌根真菌根外菌丝的方法及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种获得丛枝菌根真菌根外菌丝的方法。

3、本发明的第二个目的是提供所述方法在丛枝菌根真菌繁殖中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供所述方法在制备丛枝菌根真菌共生体中的应用。

5、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

6、本发明发现活体根外菌丝在宿主植物的根外可形成较大的连续菌丝体，在水中搅拌的过程中相互缠绕，并缠绕到添加的细小不规则形状的固体颗粒上，然后运用筛子的网格阻隔作用，将缠绕了菌丝体的固体颗粒截留在筛网上。将筛子上的截留物倒在培养皿上，加冰水浸泡。由于水的浮力作用，菌丝体与其缠绕的载体即可在冰水中呈现出肉眼可见的棉絮状菌丝团，水轻微的波动即可带动该团状体，在不借用显微镜进行放大操作条件下，即可直接用镊子或吸管收集得到am真菌的根外菌丝。

7、一种获得丛枝菌根真菌根外菌丝的方法，包括以下步骤：

8、s1.用浸泡液充分浸泡植物的根系及根系生长范围内的土壤，收集浸泡物，之后将浸泡物、固体颗粒和浸泡液混合均匀，得到混合物；

9、所述植物与丛枝菌根真菌存在丛枝菌根共生；所述浸泡液为含吐温20的冰水混合物；所述固体颗粒的表面粗糙，且密度小于水；

10、s2.对步骤s1所得混合物进行固液分离，得到泥浆和沉淀物；用筛网过滤所得泥浆，收集未过网的分离物；所述筛网的孔径等于所述固体颗粒的最大直径；

11、s3.用冰水充分浸泡步骤s2所得分离物，收集菌丝，即得到所述丛枝菌根真菌根外菌丝。

12、优选地，步骤s2包括以下步骤：

13、s21.对步骤s1所得混合物进行固液分离，得到泥浆1和沉淀物1，用所述筛网过滤所得泥浆1，收集未过网的分离物1；

14、s22.将所述浸泡液和步骤s21所得沉淀物1混合均匀，固液分离，得到泥浆2和沉淀物2，用所述筛网过滤所得泥浆2，收集未过网的分离物2。

15、更优选地，步骤s2还包括以下步骤：s23.将步骤s22重复3～4次。

16、进一步优选地，步骤s2还包括以下步骤：s23.将步骤s22重复3次。

17、优选地，所述固体颗粒为膨胀蛭石。

18、优选地，所述固体颗粒物的最大直径为0.4～0.5mm。

19、更优选地，所述固体颗粒物的最大直径为0.5mm。

20、优选地，所述冰水混合物由质量比为(1～2)：(2～6)的冰和水组成。

21、更优选地，所述冰水混合物由质量比为1：1的冰和水组成。

22、优选地，所述浸泡液中吐温20的浓度为0.05μl/ml～0.1μl/ml。

23、更优选地，所述浸泡液中吐温20的浓度为0.1μl/ml。

24、优选地，所述丛枝菌根真菌为异形根孢囊霉(rhizophagus irregularis)。

25、优选地，所述植物种植于培养盆，则步骤s1中，将所述培养盆置于所述浸泡液中浸泡，水面低于所述培养盆的盆口，泥土表面不被浸没。

26、任一所述方法在丛枝菌根真菌繁殖中的应用也应在本发明的保护范围之内。

27、任一所述方法在制备丛枝菌根真菌共生体中的应用也应在本发明的保护范围之内。

28、优选地，所述任一方法获得的所述丛枝菌根真菌根外菌丝作为繁殖体。

29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

30、本发明提供的方法，首先设计了冰水创造的低温条件，不易让丛枝菌根真菌根外菌丝失活；其次，本发明在设计了低温条件的同时，采用土温20作为去污剂，既不影响活体菌丝的蛋白活性，又能洗涤掉粘在菌丝表面的土壤颗粒，从而最大程度的使菌丝悬浮在冰水中，进而有利于菌丝体与添加的膨胀蛭石颗粒缠绕。最后，采用缠绕蛭石颗粒的菌丝体在水中波动条件下容易被识别的特性，可以不借助显微放大设备直接裸眼收集，从而做到在普通实验室条件下即可实现丛枝菌根真菌根外菌丝的快速分离和收集。

31、本发明各种操作简易，效率高，获得的根外菌丝保持了更强的活性，对宿主植物的侵染效果更好，提高根外菌丝在分离过程中的完整性，为后续的丛枝菌根真菌根外活体菌丝的生理或分子检测研究提供更加真实可靠的样本来源，且避免传统方法中为收集丛枝菌根真菌孢子而浪费活体菌丝的情况，节约资源，降低成本，可行性高。