一种检测人源细胞端粒酶活性的引物组合物及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学检测，具体涉及一种检测人源细胞端粒酶活性的引物组合物及试剂盒。

背景技术：

1、21世纪以来，细胞药物的研发和临床应用受到了国内外的高度重视。人源干细胞、体细胞以及免疫细胞具有较强的生物学及临床医学作用。人源细胞药物在治疗癌症、器官损伤以及免疫系统疾病方面皆具有很好的疗效。因细胞药物具有生物学活性，故其安全性也引起人们的高度重视。细胞致瘤性是评价其安全性的重要指标之一。

2、端粒是真核细胞染色体末端特殊的蛋白质-dna复合结构，人源细胞端粒序列由多组相同序列“5’-ttaggg-3’”组成。端粒在正常细胞分裂过程中逐渐缩短，达到临界长度时细胞便会停止分裂并触发凋亡。

3、端粒酶是由rna和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。端粒酶能以自身rna为模板复制合成端粒序列。在增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中无端粒酶活性，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在正常组织阳性率很低，因此端粒酶可作为一个广泛的肿瘤标志物，端粒酶活性也成为细胞致瘤性的一个重要指标。

4、近几年随着大量人源细胞产品上市，产品的致瘤性也成为重要的品质控制项目。

5、目前，尚无检测人源细胞端粒酶活性的标准试剂盒。常用的检测试剂盒有直接检测法试剂盒和间接检测法试剂盒。直接检测法试剂盒原理为扩增端粒重复dna序列并检测。主要以trap法(telomeric repeat amplification protocol,trap)为基础的改良方法，其试剂盒在pcr操作之后还需进行酶联免疫吸附测定(elisa)，检测时间长，操作复杂。间接检测法试剂盒原理为端粒酶催化亚基tert的表达与端粒酶活性水平成正相关，可通过检测tert的mrna表达来间接检测端粒酶活性，其方法缺陷为需提取mrna并进行逆转录再进行扩增检测，最后需对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并对结果进行凝胶图像分析，检测时间较长，操作不简便，不适用于细胞药物的生产、质检。

6、以上检测试剂盒存在各种缺陷，亟需一种准确、快速、特异性强、便捷的检测试剂盒来解决细胞药物生产、质检过程中人源细胞端粒酶活性检测的难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于找到一种检测人源细胞端粒酶活性的引物组合物及试剂盒，基于直接检测法而无需进行酶联免疫吸附测定(elisa)，使用rt-pcr快速检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒。

2、本发明是这样实现的，使用端粒酶细胞裂解液将细胞裂解获得高浓度端粒酶，使用端粒酶反应液和端粒酶反应启动引物tele-ts seq id no.3进行端粒延伸反应，将端粒酶反应产物与端粒酶活性检测pcr反应液、pcr反应引物组合tele-f seq id no.1和pcr反应引物组合tele-r seq id no.2进行rt-pcr，检测细胞端粒表达量，并根据rt-pcr的ct值判定端粒酶活性。

3、一种检测人源细胞端粒酶活性的引物组合物，检测pcr反应引物组合包括以下碱基序列：

4、tele-f：5’-ggcaatccgtacgagcagagttaag-3’seq id no.1

5、tele-r：5’-ttaagcgcggcttacccttacccttaccctaaccggcc-3’seq id no.2。

6、端粒酶反应的启动引物的碱基序列：

7、tele-ts：5’-ggcaatccgtacgagcagagttaag-3’seq id no.3。

8、一种检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，包括以下组分：

9、1)端粒酶细胞裂解液；

10、2)端粒酶反应液；

11、3)端粒酶活性检测rt-pcr反应液；

12、4)上述的rt-pcr反应引物tele-f、tele-r和上述的端粒酶反应启动引物tele-ts。

13、进一步，所述检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，包括以下单独包装的组件：

14、组件甲，用于进行细胞裂解，包括端粒酶细胞裂解液；

15、组件乙，用于进行端粒酶反应，包括端粒酶反应液、100mm dntp、0.01mm端粒酶反应启动引物tele-ts碱基序列seq id no.3；

16、组件丙，用于进行端粒酶催化的延伸反应，包括端粒酶活性检测pcr反应液、pcr反应引物组合0.01mm tele-f碱基序列seq id no.1、0.01mm tele-r碱基序列seq id no.2。

17、所述端粒酶细胞裂解液：含0.2％的ph 8.8浓度为1.5m的tris-hcl、1.6mmmgcl2·6h2o、1.1mm edta、1％np-40、0.8mm脱氧胆酸钠、10％甘油、43mm nacl、5mmβ-巯基乙醇、65mm chaps，余量为depc水，百分比为体积百分比。

18、所述端粒酶反应液：含体积百分比12％的ph 8.8浓度为1.5m的tris-hcl、67mmkcl、14mm mgcl2·6h2o、10mm egta，余量为depc水。

19、所述端粒酶活性检测pcr反应液：含0.01％pcr级的sybr green i 10000×、1.3％的ph 8.8浓度为1.5m的tris-hcl、1.3mm edta、0.14m kcl、9％甘油、26mm mgcl2·6h2o、1m甜菜碱、2％甲酰胺、129mm dtt、5％dmso、39mm硫酸铵、0.1％的浓度为2.5mm的dntp、5u/μl热启动酶，余量为无菌水，百分比为体积百分比。

20、本发明具有的优点和技术效果：不同于传统的端粒酶活性检测，本发明试剂盒通过使用pcr检测多代次、多批次hela细胞和mrc-5细胞的端粒酶活性，得到大量样本的ct值。经多次重复实验后，根据hela细胞和mrc-5细胞的端粒酶活性的特性及实验结果决定将hela细胞为阳性对照，mrc-5细胞为阴性对照，基于统计软件得出本发明中人源细胞端粒酶活性其端粒酶活性的判定标准。旧的trap方法，最后需对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并对结果进行凝胶图像分析，检测时间较长，操作不简便，不适用于细胞药物的生产、质检。本发明试剂盒仅需通过对ct值就能够直观的判断端粒酶活性的强弱，与市场中相同种类的试剂盒(telomerase activity quantification qpcr assay kit厂家：sciencell货号：8928)相比，本发明试剂盒端粒酶反应时间为1小时，telomerase activityquantification qpcr assay kit为3小时，且pcr检测出端粒酶的表达灵敏度高于市场中同种产品。本发明试剂盒具有准确、快速、灵敏度高、重复性好、操作简便、检测结果判定方法简易。为细胞药物产品大批量生产及后期质量控制提供了新的检测技术。可用于细胞药物生产、质检中人源细胞端粒酶活性的检测。

1.一种检测人源细胞端粒酶活性的引物组合物，其特征在于，检测pcr反应引物组合包括以下碱基序列：

2.根据权利要求所述检测人源细胞端粒酶活性的引物组合物，其特征在于，端粒酶反应的启动引物的碱基序列：

3.一种检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

4.根据权利要求3所述检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括以下单独包装的组件：

5.根据权利要求4所述检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述端粒酶细胞裂解液：含0.2％的ph 8.8浓度为1.5m的tris-hcl、1.6mm mgcl2·6h2o、1.1mm edta、1％np-40、0.8mm脱氧胆酸钠、10％甘油、43mm nacl、5mmβ-巯基乙醇、65mm chaps，余量为depc水，百分比为体积百分比。

6.根据权利要求4所述检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述端粒酶反应液：含体积百分比12％的ph 8.8浓度为1.5m的tris-hcl、67mm kcl、14mm mgcl2·6h2o、10mm egta，余量为depc水。

7.根据权利要求4所述检测人源细胞端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述端粒酶活性检测pcr反应液：含0.01％pcr级的sybr green i 10000×、1.3％的ph 8.8浓度为1.5m的tris-hcl、1.3mm edta、0.14m kcl、9％甘油、26mm mgcl2·6h2o、1m甜菜碱、2％甲酰胺、129mm dtt、5％dmso、39mm硫酸铵、0.1％的浓度为2.5mm的dntp、5u/μl热启动酶，余量为无菌水，百分比为体积百分比。