ApbC基因敲除的创伤弧菌菌株及其构建方法和应用

本发明涉及微生物基因工程，具体涉及apbc基因敲除的创伤弧菌菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、创伤弧菌是一种革兰氏阴性细菌，是最具侵袭性的弧菌属物种之一。这类机会性致病菌在温暖的月份快速增殖，并在软体贝类中大量积累，能够引起人类快速的致命性感染。感染途径包括食用受污染的海鲜引起的胃肠道症状、严重原发性败血症，开放性伤口暴露于受污染的水体导致的伤口感染等。原发性败血症的病死率高于50%，死亡通常发生在住院72小时内。因此，探究创伤弧菌的致病机制对于降低创伤弧菌病死率至关重要。

2、大多数由创伤弧菌引起的败血症病例与基础疾病有关，特别是肝硬化、慢性肾衰竭和血色病，这些疾病通常都会导致血清铁水平升高。因此，铁过载被认为是病情进展的主要因素之一。宿主的免疫系统在增强对创伤弧菌的易感性中起重要作用，动物体内的铁促进了创伤弧菌的生长，内毒素增加，诱导分泌肿瘤坏死因子α（tnf-α）；同时，过量的铁降低了中性粒细胞的活性。除了这些毒力因子之外，由于创伤弧菌生长速率增加，其也表现出杀死宿主细胞的细胞毒性，而且铁过载也可影响先天性和获得性免疫应答。

3、铁和硫对几乎所有细菌都是必需的，以fe-s簇作为辅因子的铁-硫蛋白质执行多种重要的细胞过程，例如电子传递、代谢反应和基因调节等，并且分布广泛。apbc是一类独特的进化上保守蛋白质的代表性成员，其可以结合瞬时fe-s簇并激活脱辅基蛋白，促进fe-s簇转移。

4、因此，可以推测apbc基因在创伤弧菌铁-硫蛋白生物合成中发挥重要作用。构建apbc基因敲除的创伤弧菌有利于研究apbc基因对于创伤弧菌生长和毒力的影响，进一步探究铁硫簇系统与创伤弧菌致病机制的联系。但是，目前并未有记载构建出apbc基因敲除的创伤弧菌以及相应的构建方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种apbc基因敲除的创伤弧菌菌株及其构建方法和应用，该菌株是通过同源重组方法将apbc基因敲除并利用细菌间的接合转移构建而得，构建方法简单，易操作，菌落筛选效率高，合成效率高，构建出的apbc基因敲除的创伤弧菌菌株中缺失apbc基因片段，apbc基因片段的缺失可影响创伤弧菌铁-硫蛋白（fe-s蛋白）合成且不致死，通过将该apbc基因敲除的创伤弧菌菌株与创伤弧菌野生株的比较可更为准确研究apbc基因对创伤弧菌生物学特性的影响以及铁硫簇系统重要的生物学功能，用于揭示apbc基因对创伤弧菌铁硫利用的影响，进一步研究细菌的毒力和生存能力。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种apbc基因敲除的创伤弧菌菌株，所述apbc基因敲除的创伤弧菌菌株中缺失apbc基因片段；

4、所述apbc基因敲除的创伤弧菌菌株的分类命名为vibrio vulnificus △apbc（v.v-△apbc），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no：m20232565，保藏日期为2023年12月15日。

5、进一步地，所述菌株fe-s蛋白合成缺陷。

6、本发明的第二方面，提供一种apbc基因敲除的创伤弧菌菌株的构建方法，包括如下步骤：

7、（1）构建apbc基因缺失的重叠片段

8、该步骤采用重叠延伸pcr方法扩增获得apbc基因敲除的重叠片段，具体步骤如下：

9、1.1根据目的基因序列，分别设计apbc f1/r1、apbc f2/r2两对引物，从创伤弧菌基因组中分别扩增出apbc基因的上游、下游片段。其中，引物apbc f1、r2在设计时于5’端分别加入酶切位点，引物apbc f2、r1在设计时于5’端分别加入15-20bp重叠序列；

10、1.2以步骤1.1产物的上游、下游序列为模板，加入引物apbc f1、apbc r2进行pcr扩增，得到apbc基因缺失的重叠片段。

11、（2）构建重组自杀质粒pdm4-△apbc

12、2.1将获得的apbc基因缺失的重叠片段根据引物设计的酶切位点进行双酶切，自杀质粒pdm4也用同种限制性内切酶酶切；

13、2.2将酶切后的apbc基因缺失的重叠片段与自杀质粒pdm4连接，构建重组自杀质粒pdm4-△apbc；

14、2.3将连接产物热激转化至感受态大肠杆菌dh5α λpir内，涂布在含10μg/ml氯霉素的lb平板上进行筛选，利用引物cat-f、cat-r对阳性克隆进行pcr扩增鉴定并进行测序；将测序正确的重组质粒命名为pdm4-△apbc并保存菌株；利用质粒提取试剂盒提取自杀质粒pdm4-△apbc；

15、2.4将步骤2.3提取的自杀质粒pdm4-△apbc以相同的热激转化的方法导入接合作用供体菌e.coli s17-1 λpir内。

16、（3）细菌的接合转移

17、该步骤通过供体菌和受体菌直接接触，将重组质粒导入受体菌内而发生同源重组，具体步骤如下：

18、3.1取野生型创伤弧菌与e.coli s17-1 λpir菌液混合离心，重悬后接种于bhi厚血平板，30℃条件下培养24h；

19、3.2再使用bhi培养基充分吹悬菌斑，将悬液离心后再重悬；

20、3.3将此菌液倍比稀释，涂布于含10μg/ml氯霉素和12.5μg/ml多粘菌素e的bhi血平板上，37℃条件下培养至出现菌落；

21、3.4挑取单菌落至含有12.5μg/ml多粘菌素e的bhi液体培养基中，摇床培养至肉眼可见，利用引物apbc f1、apbc r2进行菌液pcr鉴定，获得第一重组菌落。

22、（4）基因缺失突变株的筛选

23、该步骤通过利用质粒的蔗糖抗性基因进一步筛选阳性克隆，具体步骤如下：

24、4.1挑取阳性克隆至bhi液体培养基中静置过夜，离心后使用bhi培养基重悬；用pbs将菌液倍比稀释10、100、1000、10000倍，涂布于含10wt%蔗糖的bh固体平板上，37℃条件下在培养箱过夜培养；

25、4.2挑取在含10wt%蔗糖的bhi固体平板上的菌株，分别点在含10μg/ml氯霉素和不含氯霉素的bhi固体平板上，培养箱培养；在含10μg/ml氯霉素的bhi固体平板上不生长、在不含氯霉素的bhi固体平板上生长的为可疑基因缺失突变菌株；挑取无氯霉素抗性菌株，再进行重复以上操作，防止假阳性的出现；

26、4.3挑取无氯霉素抗性的目标菌株，接种到bhi液体培养基中，利用引物mutapbc-f、mutapbc-r进行pcr鉴定并提基因组进行测序；保存测序正确的菌株，最终获得创伤弧菌apbc基因敲除菌株v.v-△apbc。

27、本发明的第三方面，提供一种apbc基因敲除的创伤弧菌菌株的应用，所述apbc基因敲除的创伤弧菌菌株用于研究创伤弧菌中apbc基因的功能。

28、具体地，所述apbc基因敲除的创伤弧菌菌株在研究创伤弧菌致病机理中的应用。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、（1）本发明首次将多粘菌素和氯霉素联合使用作为筛选用抗生素，创伤弧菌自身具有多粘菌素抗性，第一轮筛选中通过多粘菌素与氯霉素的联合使用，大大提高了第一重组菌落筛选的效率；

31、（2）利用重叠pcr技术获得了上下游同源臂的融合片段，并连接于自杀质粒pdm4，通过热激导入感受态大肠杆菌dh5α λpir中复制，获得大量重组质粒，提高了后续接合转移的效率；

32、（3）本发明通过同源重组方法将apbc基因敲除并利用细菌间的接合转移构建出apbc基因敲除的创伤弧菌菌株，构建方法简单，易操作，菌落筛选效率高，合成效率高，构建出的apbc基因敲除的创伤弧菌菌株中缺失apbc基因片段，因铁-硫蛋白多参与细菌重要生命过程，在进化上高度保守，敲除多会导致细菌死亡，导致研究困难，apbc基因片段的缺失可影响创伤弧菌铁-硫蛋白合成且不致死，通过将该apbc基因敲除的创伤弧菌菌株与创伤弧菌野生株的比较可更为准确研究apbc基因对创伤弧菌生物学特性的影响以及铁硫簇系统重要的生物学功能，用于揭示apbc基因对创伤弧菌铁硫利用的影响，进一步研究细菌的毒力和生存能力。