一种检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的试剂盒及其应用

本发明属于现代化农业，具体涉及一种一种检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、由棕榈疫霉菌（ phytophthora palmivora）侵染引起的榴莲根腐病是我国及泰国、缅甸、越南和马来西亚等榴莲产地发生最严重的病害，制约榴莲产业的蓬勃发展。该病原菌寄主范围广泛，并能在榴莲植物的不同部位引起疾病。病原菌的田间快速检测是有效预防病害发生的关键手段，当前对于引起榴莲根腐病的棕榈疫霉菌的诊断主要通过症状观察、病原菌分离鉴定和基于pcr的常规方法。这些方法耗时长且容易导致延迟诊断；对于缓慢生长的病原菌可能漏检；存在交叉反应和假阳性问题。此外，传统技术通常需要专业人员操作，且对设备设施要求较高，增加了成本和复杂性。因此，亟需探索和发展更快速、准确、简便的棕榈疫霉菌检测方法。

2、目前，传统的植物病害鉴定方法包括病原菌的分离、培养和形态学鉴定，同时进行病原菌的致病性验证，最终结合分类资料确定病原菌的分类和地位。这种方法虽然是病原菌鉴定的基础，但易受操作者技能和经验、人为因素以及环境影响，耗时且无法满足快速检测的需求。

3、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）于1983年由mullis提出，这种方法迅速促进了许多科学领域和诊断学领域的重大进展。该方法是在受控条件下反复加热和冷却样品，通过耐热性dna聚合酶扩增dna。在此基础上形成了实时荧光定量pcr等一些列新方法，由于其良好的特异性和可操作性而在病原菌的鉴定及检测中发挥重要作用。但基于pcr的技术对高精度热循环器的要求使得这种强大的方法无法被广泛应用于田间现场检测。

4、环介导等温扩增（loop-mediated isthermal amplification，lamp）由notomi及其同事于2000年开发，该方法依赖于具有高链置换活性的dna聚合酶和一套特殊设计的两个内部和两个外引物进行的自动循环链置换dna合成，允许在1小时内快速准确地对病原物进行诊断。由于其只需常规的水浴锅等设备，且操作简单、快速、灵敏而在细菌、真菌、病毒等病原物的检测中广泛应用。

5、综上所述，随着生物技术的发展，越来越多分子检测相关技术被挖掘、优化并应用到病原物的检测当中，但他们也同样存在着自身的局限性。病原菌分离鉴定的传统方法通常耗时且繁琐，需要复杂的培养条件和设备。此外，传统方法在某些情况下可能出现误判，导致结果不够准确和可靠。pcr技术虽然应用范围较广，但其对温控设备的依赖程度高，操作耗时长，专业性强，难以应用于现场检测。环介导等温扩增技术（lamp）灵敏度高、特异性强，但其引物设计及试剂添加繁琐、操作复杂，所需温度较高，易导致非特异性扩增等特点而影响检测结果。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的试剂。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的试剂盒。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种基于rpa结合crispr/cas12a的榴莲根腐病棕榈疫霉菌的检测方法。

5、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：

6、本发明的第一个方面，提供一种检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的试剂，所述试剂包括检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌基因组的引物对和/或检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的crrna；

7、所述引物对为rpa-f/rpa-r，核苷酸序列如下：

8、rpa-f：5’-ccagagggtacaaacgaaatcggcgctacg-3’；

9、rpa-r：5’-cctaccggtatgcctcgtgatcattgg-3’；

10、所述crrna包括crrna1和crrna2，核苷酸序列分别如seq id no:4和seq id no:5所示。

11、在本发明的第一个方面中，所述引物对基于棕榈疫霉菌特异序列>nckw01006925进行设计。

12、本发明的第二个方面，提供一种检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的试剂盒，包含本发明第一个方面所述的试剂。

13、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括ssdna荧光探针和cas蛋白。

14、在本发明的一些实施方式中，所述cas蛋白选自mb4cas12a、fncas12a、lbcas12a或dlbcas12a中的至少一种。

15、在本发明的一些实施方式中，所述ssdna荧光探针的两端分别修饰荧光基团和淬灭基团。

16、在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团选自fam、cy5、htx、rox、vic、tamra和hex中的任一种。

17、在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2和bhq3中的任一种。

18、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括rpa反应液和crispr/cas12a缓冲液。

19、在本发明的一些实施方式中，所述crispr/cas12a缓冲液为10 ×nebuffertmr2.1。

20、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

21、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述试剂、和/或本发明第二个方面所述试剂盒在1）~2）中任一项所述的应用：

22、1）榴莲根腐病棕榈疫霉菌的检测；

23、2）制备检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的产品。

24、本发明的第四个方面，提供一种基于rpa结合crispr/cas12a的榴莲根腐病棕榈疫霉菌的检测方法，包括采用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的步骤。

25、在本发明一些实施方式中，所述检测方法具体包括以下步骤：

26、（1）提取待测样本的核酸；

27、（2）将引物对与步骤（1）中的核酸混合，进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；

28、（3）将步骤（2）所述的rpa扩增产物与crrna、cas蛋白、ssdna荧光探针混合，进行crispr反应，读取检测信号；

29、（4）根据检测信号判定待测样本是否含有榴莲根腐病棕榈疫霉菌。

30、在本发明的一些实施方式中，所述rpa扩增条件为37～42℃，反应5～30分钟。

31、在本发明的一些实施方式中，所述crrna和cas12a的浓度均为200～1000 nm。

32、在本发明的一些实施方式中，所述ssdna荧光探针的浓度为1～100 μm。

33、在本发明的一些实施方式中，所述crrna1和crrna2的摩尔比例为（1~3）：（1~3）。

34、在本项发明实施过程中，所述检测方法步骤如下：

35、（1）将rpa反应体系和待检样本基因组dna混匀后放入反应管底部，crispr/cas12a反应体系混匀后放入所述反应管盖中，然后将所述管底置于恒温扩增装置中进行目的片段的rpa扩增；所述目的片段包括如seq id no:1所示的核苷酸序列。

36、（2）所述rpa扩增结束后，将所述反应管盖中的crispr/cas12a体系加入反应管中，混匀。

37、（3）可视化检测步骤（2）中反应液的荧光强度。

38、若所述反应管发出荧光，表明所述待检样本中存在榴莲根腐病棕榈疫霉菌；若所述反应管中未发出荧光，表明所述待检样本中不存在榴莲根腐病棕榈疫霉菌。

39、在本项发明实施过程中，可视化检测（2）中反应管荧光强度包括：

40、将反应管置于38℃恒温装置中进行rpa反应15分钟，然后将管盖上的crispr/cas12a反应液离心至管底继续反应20分钟，期间每间隔30秒采集一次fam荧光；或者在38℃恒温装置中反应20分钟后，肉眼观察反应管在蓝光照射下是否出现荧光。

41、本发明开发了一种榴莲根腐病棕榈疫霉菌的快速可视化检测试剂和试剂盒，具有如下有益效果：

42、（1）本项发明是通过对榴莲根腐病棕榈疫霉菌、大豆疫霉菌、致病疫霉菌等病原卵菌和稻瘟病菌、禾谷镰刀菌等病原真菌的全基因组序列进行系统比对和筛选获得榴莲根腐病棕榈疫霉菌特异序列>nckw01006925，且该序列尚属于未知功能的区域，迄今为止未在检测技术及相关文献中得到应用。该序列的发现实现了对于榴莲根腐病棕榈疫霉菌的特异性检测。

43、（2）本项发明利用棕榈疫霉菌特异序列>nckw01006925设计并筛选crispr/cas12a系统的crrna，并根据该crrna的结合位点设计并筛选特异性rpa引物，以实现rpa特异性靶基因扩增及棕榈疫霉菌的特异性检测。

44、（3）本项发明创新性利用两条crrna序列进行检测，其检测灵敏度比一条crrna高一个数量级，大大提高检测的灵敏性及准确率。

45、（4）本项发明的试剂用于检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌，其中包含引物对和crrna。该引物对可用于rpa等温扩增技术，以便准确、快速且特异地对榴莲根腐病棕榈疫霉菌进行检测；crrna可与榴莲根腐病棕榈疫霉菌特异片段形成互补双链而不会与其他卵菌、疫霉菌及真菌序列发生交叉反应，从而提高了对榴莲根腐病棕榈疫霉菌的检测特异性。

46、本项发明将rpa系统与crispr/cas12a系统相结合，创立了一种能快速且可视化检测棕榈疫霉菌的方法。具体来说，该方法通过基因组序列比对获得了榴莲根腐病棕榈疫霉菌特异片段，以此片段设计并筛选了crispr/cas12a系统的crrna探针及rpa引物，从而实现rpa对靶基因的特异性扩增。此外，本发明利用crispr/cas12a系统对报告基因进行切割，以此建立适用于榴莲根腐病棕榈疫霉菌的快速检测方法。该方法经过rpa和crispr/cas12a体系的优化，对检测方法的灵敏性和特异性均进行了评估。结果显示：该方法对榴莲根腐病棕榈疫霉菌的检测可在30分钟内完成，具有良好特异性且无交叉反应，灵敏度达到10 fg/μl。该方法基于crispr/cas12a所具有的反式切割活性，针对榴莲根腐病棕榈疫霉菌的特异片段进行快速、灵敏且特异的检测，无需昂贵或大型仪器设备，采用简单、便携的可视化闭管检测方法，适用于现场和田间样本的快速检测。

47、（5）该方法将crrna与目的序列的特异识别和rpa的特异性扩增相结合，增强了crispr/cas12a技术检测的灵敏性和特异性。在38℃条件下进行检测，适用于实验室或现场没有pcr仪器设备的情况，同时可以利用蓝光照射并肉眼观察检测结果。

48、综合而言，基于rpa-crispr/cas12a荧光检测榴莲根腐病棕榈疫霉菌的方法比传统的培养方法具有更高的灵敏度，并且检测时间大大缩短，30分钟内即可完成检测。这种方法操作简便、快捷、灵敏且具有很强的特异性，全程在38℃环境下进行，对仪器设备要求不高，适合广泛在海关口岸现场检测中应用，具有良好的前景。