一种miRNA在制备用于肺癌耐药诊断产品中的用途的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种肺癌耐药诊断的生物标志物，尤其涉及一种mirna在制备用于肺癌耐药诊断产品中的用途。

背景技术：

1、目前，肺癌最常用的治疗方法是手术联合化疗，常用的化疗药物包括顺铂(cis-dichlorodiamine-platinum，ddp)和紫杉烷类。其中，ddp通过靶向dna和拓扑异构酶ii(type ii topoisomerase,topo ii)，抑制肿瘤细胞dna的合成和修复，诱导细胞凋亡，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。以铂类为基础的化疗在非小细胞肺癌的治疗中，早期能提高治愈率，晚期能延长生存期，然而一旦出现药物耐药就很难取得令人满意的治疗效果。肺癌患者的ddp耐药率为63％，严重影响了患者的预后和生存质量。因此，探讨肺癌顺铂耐药的生物标志物，开发新的顺铂耐药诊断检测试剂盒，可对肺癌的顺铂耐药进行筛查，以指导临床用药做出调整。

2、传统的对肺癌的诊断需借助支气管镜活检、痰找肿瘤细胞、胸水找肿瘤细胞、肺穿刺活检、胸腔镜肺活检、纵隔或浅表淋巴结活检、胸片(x线检查)等手段，这些检查方式对病人的损害较强，经济成本较高。

3、mirnas是一类内源性的不编码蛋白的微小rnas，长度一般为18-24个核苷酸，可通过与目标mrna的互补序列相结合，在转录水平对基因的表达进行调控，导致目标mrna的降解或者基因沉默。mirnas在肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、迁移和侵袭，及肿瘤细胞对药物治疗的应答中发挥重要调控作用。

4、发明人张义彬先前研究发现，mir-4725-5p在肺癌患者血浆及细胞系中高表达，并可能通过调控靶基因cdh1的表达，从而促进肺癌细胞的增殖、迁移及对顺铂治疗的耐药性(张义彬.mir-4725-5p靶向抑制cdh1调控肺癌增殖、迁移和顺铂耐药的机制研究[d].湖北中医药大学,2022.doi:10.27134/d.cnki.ghbzc.2022.000128.)。

5、上述先前研究初步探讨了mir-4725-5p在肺癌细胞中作用的分子机制，发现cdh1是mir-4725-5p的潜在靶基因，mir-4725-5p在cdh1的3’utr区域有两个结合位点。e-cadherin在高侵袭转移的肿瘤细胞中缺失或显著下调，过表达mir-4725-5p能显著下调e-cadherin的蛋白表达水平，这可能是mir-4725-5p促进肺癌细胞迁移和顺铂耐药的分子机制之一。然而，e-cadherin也受到pi3k、mapk等信号通路的调控，mir-4725-5p在肺癌细胞中是否通过直接靶向cdh1调控e-cadherin的蛋白表达还需要进一步用报道基因实验来验证。也就是说，该研究虽然初步报道了mir-4725-5p在肺癌细胞中作用的分子机制，但其在预测肺癌增值、转移或顺铂耐药中存在不全面的隐患，没有进一步验证是否存在其他的机制，如其他的mirna同样影响肺癌增值、转移或顺铂耐药，即单一标志物检测有可能出现假阳性。此外，上述文献也没有报道mir-4725-5p所对应的特异性引物。

6、因此，临床上急需寻找到经济效益大、稳定性高的顺铂耐药诊断标志物，并设计出相应的特异性引物，开发出诊断试剂盒，用于顺铂耐药诊断，以在临床上能够在早期、快速的判断出患者可能会出现药物耐受的情况，从而对临床用药做出指导与调整，避免发生耐药而耽误患者的最佳治疗窗口。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术提出一种mirna在制备用于肺癌耐药诊断产品中的用途。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本技术提供一种mirna的检测试剂在制备用于肺癌耐药诊断产品中的用途，其特征在于，所述mirna选自mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718中的至少一种。

4、本发明中可采用现有mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的检测试剂用于肺癌耐药诊断，也可采用自主设计的引物组所制备的检测试剂用于肺癌耐药诊断，以能够实现mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的相对表达量的定量检测为前提。

5、作为优选方案，所述mirna选自mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718中的任意一种，或者选自mir-1207-5p和mir-1915-3p的组合，mir-1207-5p和mir-718的组合，mir-1915-3p和mir-718的组合，mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718的组合中的任意一组。作为优选方案，所述mirna的检测试剂包括用于mirna的引物组，所述引物组包括茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物。

6、作为进一步的优选方案，所述引物组包括以下组中的至少一组：

7、(1)用于mir-1207-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.1～3所示；

8、(2)用于mir-1915-3p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.4～6所示；

9、(3)用于mir-718的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.7～9所示。

10、作为优选方案，所述肺癌耐药为铂类药物化疗引起的肺癌耐药。

11、作为进一步的优选方案，所述铂类药物选自顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂中的至少一种；更优选为顺铂。

12、作为优选方案，所述诊断产品包括诊断试剂盒、诊断芯片中的任一种。

13、第二方面，本技术提供一种mirna的检测试剂在制备用于肺癌耐药诊断产品中的用途，所述mirna包括mir-4725-5p，还包括mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718中的至少一种。

14、作为优选方案，所述mirna选自mir-4725-5p和mir-1207-5p的组合，mir-4725-5p和mir-1915-3p的组合，mir-4725-5p和mir-718的组合，mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-1915-3p的组合，mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-718的组合，mir-4725-5p和mir-1915-3p、mir-718的组合，mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的组合中的任意一组。

15、作为进一步的优选方案，所述mirna为mir-4725-5p和mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718的组合。

16、作为优选方案，所述mirna的检测试剂包括：用于mir-4725-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.10～12所示；

17、以及以下组中的至少一组：

18、(1)用于mir-1207-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.1～3所示；

19、(2)用于mir-1915-3p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.4～6所示；

20、(3)用于mir-718的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.7～9所示。

21、作为进一步的优选方案，所述mirna的检测试剂包括：用于mir-4725-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.10～12所示；

22、用于mir-1207-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.1～3所示；

23、用于mir-1915-3p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.4～6所示；

24、用于mir-718的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.7～9所示。

25、第三方面，本技术提供一种引物组合，其特征在于，包括以下组中的至少一组：

26、(1)用于扩增mir-1207-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.1～3所示；

27、(2)用于扩增mir-1915-3p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.4～6所示；

28、(3)用于扩增mir-718的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.7～9所示；

29、(4)用于扩增mir-4725-5p的茎环结构逆转录引物、pcr上游引物和pcr下游引物，核苷酸序列如seq id no.10～12所示。

30、第四方面，本技术提供一种mirna的检测试剂，其特征在于，包括权利要求9所述的引物组合。

31、作为优选方案，所述检测试剂还包括逆转录酶、缓冲液、dna聚合酶和dntp。

32、第五方面，本技术提供一种基于前述的mirna的检测试剂的检测方法，包括以下步骤：提取样本的rna，进行逆转录反应将rna逆转录为cdna，再将cdna进行实时荧光定量pcr，即得mirna的相对表达量。

33、作为优选方案，所述样本包括血浆样本、细胞样本中的任一种。

34、第六方面，本技术提供一种肺癌耐药诊断试剂盒，包括前述的mirna的检测试剂。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

36、1)本发明首次发现了mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718与肺癌化疗耐药密切相关，其在耐药肺癌患者和不耐药肺癌患者的表达水平呈现显著性差异(p<0.05)，且进一步通过细胞实验验证了mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718在肺癌顺铂耐药的细胞a549/ddp和肺癌不耐药的细胞a549中的表达水平也呈现显著性差异(p<0.0001)。

37、2)本发明以mir-1207-5p、mir-1915-3p、mir-718和mir-4725-5p作为联合检测指标通过roc曲线得到的auc为0.910，灵敏度为82.32％，特异度为90.1％，由此证明了采用mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718作为联合检测指标用于诊断肺癌患者耐药敏感性及在顺铂治疗过程中进行监测的可行性，以指导临床的用药。且血浆的检查相对支气管镜活检等方法对病人的损害小，经济效益大。

38、3)本发明还对a549/ddp和a549细胞进行了细胞耐药实验，发现过表达mir-1207-5p、mir-1915-3p和mir-718能改变a549/ddp细胞和a549细胞对顺铂的敏感程度。