一种胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养模型的构建方法

本发明涉及细胞工程，具体涉及一种胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养模型的构建方法。

背景技术：

1、胃癌发生率很高，威胁国民健康，尤其是侵袭性的，为了能更好的探究出胃癌是如何原位侵袭并进一步实现转移的，本领域急需寻找一种技术方案可以在体外成功模拟出胃癌发展的第一步—原位侵袭。目前与肿瘤类器官共培养方案为两种：正常类器官与肿瘤类器官共培养、正常细胞与肿瘤类器官共培养。

2、正常类器官与肿瘤类器官共培养方案：（1）将两种类器官消化成单细胞，这破坏了类器官的结构，不能发挥类器官模拟体内环境的优势。本专利考虑到此问题，并未将功能性人类胃肠道类器官与胃癌类器官消化成单细胞。（2）两种类器官按1:1细胞数目比例混合，未能按体内实际比例混合，不能很好模拟体内情况。本专利考虑到此问题，将胃癌类器官注射至功能性人类胃肠道类器官的胃黏膜层空腔中，模拟了体内胃癌浸润黏膜及肌层过程，为了解胃癌进展机制及发现靶向治疗提供理想的实验平台。

3、正常细胞与肿瘤类器官共培养方案：（1）简单地把胃正常细胞与胃癌类器官共培养，并不能在体外模拟胃生理结构与环境，由此不能达到模拟体内胃癌浸润目的。

4、因此，现在亟需构建能模拟胃结构与功能的功能性人类胃肠道类器官，将其与胃癌类器官共培养，模拟体内胃癌浸润黏膜及肌层过程。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明公开了一种胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养模型的构建方法，构建了一种模拟胃癌在胃黏膜及肌层浸润生长的体外类器官模型，为了解胃癌进展机制及发现靶向治疗提供理想的实验平台。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

3、本发明公开了一种胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

4、步骤1. 胃癌类器官培养；

5、步骤2. 功能性人类胃肠道类器官培养；

6、步骤3. 胃癌类器官和功能性人类胃肠道类器官共同培养：

7、（1）收集步骤1所得的成熟的胃癌类器官，用类器官专用解离剂消化，离心，弃胶，以1×104个/ml的密度重悬于dmem/f12基础培养基中；

8、（2）将步骤2得到的功能性人类胃肠道类器官接种在胶滴中，置于37℃孵箱中10min；

9、（3）在无菌工作台内，用内径大于0.1mm的玻璃显微注射针吸取步骤2中胃癌类器官悬液，将其加载到显微注射设备上；

10、（4）在立体显微镜下将（3）吸取的胃癌类器官悬液注射至（2）所得的功能性人类胃肠道类器官的黏膜层一侧的空腔中，并加入共培养专用培养基，每3天更换。

11、进一步地，步骤3（1）所述解离剂消化时间为4min，然后离心，得不含基质胶的完整胃癌类器官。

12、进一步地，步骤3（2）功能性人类胃肠道类器官接种比例为1:6。

13、进一步地，步骤3（4）所述共培养专用培养基组分组成：基础培养基、谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、原代细胞抗生素、血清添加剂b27、血清添加剂n2、表皮生长因子、wnt-3a重组蛋白、r-spondin1重组蛋白、头蛋白、rock抑制剂、成纤维细胞生长因子10、胃泌素i、tgfβ抑制剂和糖原合成酶激酶3抑制剂；

14、所述共培养专用培养基的总体积计：1x基础培养基、2 mm谷氨酰胺、13mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、50µg/ml原代细胞抗生素、50x血清添加剂b27、100x血清添加剂n2、100ng/ml表皮生长因子、100ng/ml wnt-3a重组蛋白、1µg/ml r-spondin1重组蛋白、100ng/ml头蛋白、10µmrock抑制剂、200ng/ml成纤维细胞生长因子10、10nm胃泌素i、2µm tgfβ抑制剂和2µm糖原合成酶激酶3抑制剂。

15、本发明还公开了一种模拟胃癌在胃黏膜及肌层浸润生长的体外类器官模型，其特征在于，通过如上任一项所述胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养方法构建得到。

16、本发明还公开了一种胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养模型，其特征在于，通过如上任一项所述胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养方法构建得到。

17、本发明还公开了一种根据上述所述的模拟胃癌在胃黏膜及肌层浸润生长的体外类器官模型或上述所述的胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养模型在研究胃癌侵袭胃黏膜及肌层过程及相关机制方面的应用。

18、本发明还公开了一种胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养培养基，其特征在于，所述共培养专用培养基组分组成：基础培养基、谷氨酰胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、原代细胞抗生素、血清添加剂b27、血清添加剂n2、表皮生长因子、wnt-3a重组蛋白、r-spondin1重组蛋白、头蛋白、rock抑制剂、成纤维细胞生长因子10、胃泌素i、tgfβ抑制剂和糖原合成酶激酶3抑制剂；

19、所述共培养专用培养基的总体积计：1x基础培养基、2mm谷氨酰胺、13mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、50µg/ml原代细胞抗生素、50x血清添加剂b27、100x血清添加剂n2、100ng/ml表皮生长因子、100ng/ml wnt-3a重组蛋白、1µg/ml r-spondin1重组蛋白、100ng/ml头蛋白、10µmrock抑制剂、200ng/ml成纤维细胞生长因子10、10nm胃泌素i、2µm tgfβ抑制剂和2µm糖原合成酶激酶3抑制剂。

20、进一步地，上述任一项所述的胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养培养基在构建胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养模型中的应用。

21、进一步地，上述任一项所述的胃癌类器官与功能性人类胃肠道类器官共培养培养基在构建模拟胃癌在胃黏膜及肌层浸润生长的体外类器官模型中的应用。

22、本发明首次提出先分别制备胃癌类器官及功能性人类胃肠道类器官。然后对胃癌类器官进行gfp转染并筛选稳定株。之后，收集成熟并稳定转染的胃癌类器官，用类器官专用解离剂消化4min后离心，以1×104个/ml的密度重悬于dmem/f12基础培养基中。将功能性人类胃肠道类器官按1:6接种在新的50µl胶滴中，并置于37℃孵箱中10min。在无菌工作台内，用内径大于0.1mm的玻璃显微注射针吸出约5µl胃癌类器官悬液，并加载到显微注射设备上。在立体显微镜下，将胃癌类器官悬液注射至每个成熟的功能性人类胃肠道类器官的空腔中，加入共培养专用培养基，并每3天更换一次。注射后24h，利用荧光显微镜验证胃癌类器官在功能性人类胃肠道类器官中的存活情况，随后利用共聚焦显微镜观察胃癌类器官的生长及其对功能性人类胃肠道类器官的侵袭行为。共培养类器官进行石蜡包埋切片后，利用共聚焦显微镜确定侵袭区域，用fiji软件中的roi功能测量侵袭区域面积，再用细胞计数功能对gfp+细胞进行计数，从而得出共培养模型中gfp+细胞数量及密度。

23、与现有技术比，本发明的有益效果如下。

24、本发明公开了一种模拟胃癌在胃黏膜及肌层浸润生长的体外类器官模型，为了解胃癌进展机制及发现靶向治疗提供理想的实验平台。

25、本发明所公开的构建方法，缩短类器官解离剂消化时间，仅分离基质胶和类器官，未将胃癌类器官和功能性人类胃肠道类器官消化成单细胞，保留类器官3d结构，发挥类器官模拟机体的优势。

26、现有技术简单地把胃正常细胞与胃癌类器官共培养，并不能在体外模拟胃生理结构与环境，由此不能达到模拟体内胃癌浸润目的。本发明考虑到空间位置关系，通过显微注射设备将胃癌类器官注射至功能性人类胃肠道类器官的黏膜层一侧的空腔中，模拟了胃癌浸润肌层这一过程。