一种杂化水凝胶固定双酶级联反应器及其制备方法与应用

本发明涉及固定化酶工程，具体涉及一种杂化水凝胶固定双酶级联反应器及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多酶级联反应是指由多种酶协同参与逐级催化的过程，前一种酶催化形成的产物(或中间体)可作为后续酶的底物继续参与下一步酶催化反应。多酶级联反应的中间产物在不同酶的活性位点之间转运，可以保持中间体的高局部浓度，以及减少物质输送过程中的扩散损失，实现了特异、专一、高效的催化反应。受此启发，人们将不同功能的多种酶通过物理、化学或生物方法限制或定位于特定的载体表面或内部，依据多酶级联反应的高效协同催化机理而构建了固定化多酶级联反应器。其综合了多酶级联反应的协同高效性和固定化酶优良的稳定性、可重复使用性，可将不同酶的催化特性结合起来，增加酶周围的反应物浓度，从而显著地提高酶催化效率。其中葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶因其原料简单、多种条件下能稳定进行级联反应常被用来构建的固定化双酶级联反应器。

2、适宜的固定化载体和固定化工艺是构建高活性和高协同性双酶级联反应器的基础。金属有机框架(mof)是由金属阳离子簇与具有三维网络结构的有机配体配位而成，具有高结晶度和孔隙率。在各种mof材料中，zif-8由于其温和的合成条件，良好的水热稳定性，大的比表面积和可调节的孔径，在酶固定化如包封、孔吸附方面具有重要的应用前景，成为酶固定化的常用新型载体材料。但是大多zif材料在酸性环境下会被逐渐降解，并丧失其多孔结构，导致其中固定化的酶泄露，且粉末形式存在的zif-8固定化酶在使用过程难以分离重复使用。

3、高分子水凝胶因其优异的酶相容性、刺激响应性和结构的灵活多变被认为是固定化酶的理想载体材料。水凝胶固定化酶可为其内部固定化的酶提供亲水微环境而保持酶的活性，并可通过外界刺激来改变其亲疏水性或体积来调控固定化酶的活性。但传统的水凝胶固定化酶制备过程使用的化学交联方法会破坏酶的空间结构，从而降低酶的活性。

4、因此，需开发一种新的杂化水凝胶固定化酶级联反应器，能够对多酶进行原位固定，且能够保留多酶活性。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种杂化水凝胶固定化双酶级联反应器及其制备方法与应用，级联反应器中包括反应核及所述反应核表面的水凝胶层；所述反应核包括包裹在zif-8中的组合酶；所述水凝胶层包括杂化水凝胶；所述杂化水凝胶通过gox在o2存在下氧化葡萄糖反应生成h2o2，生成的h2o2传递给hrp催化底物acac产生acac自由基，从而引发单体与交联剂发生自由基共聚合形成包裹zif-8复合物的杂化水凝胶三维交联网络。

2、第一方面，本发明提供一种杂化水凝胶固定化双酶级联反应器，所述杂化水凝胶固定化双酶级联反应器中包括反应核及所述反应核表面的杂化水凝胶层；

3、所述反应核包括固定化双酶zif-8复合物；

4、所述固定化双酶zif-8复合物包括zif-8、包裹在zif-8中的组合酶。

5、可选地，所述组合酶包括葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶、吡喃糖氧化酶/辣根过氧化物酶中任意一种。

6、可选地，所述杂化水凝胶层包括单体自由基聚合物。

7、可选地，所述单体包括水溶性单体；所述水溶性单体包括n,n-二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇丙烯酸酯、丙烯酸羟乙酯中任意一种。

8、第二方面，本发明提供一种杂化水凝胶固定化双酶级联反应器的制备方法，包括以下步骤：

9、在硝酸锌溶液中，加入所述组合酶，2-甲基咪唑，搅拌2-4h，离心，洗涤，干燥后制得固定化双酶zif-8复合物；

10、所述硝酸锌中锌离子与2-甲基咪唑摩尔比1：4；所述组合酶中两种酶的质量比为(1-2)：(1-3)；

11、在水中，所述组合酶的催化下，交联剂作用下，固定化双酶zif-8复合物与所述单体、底物，聚合制得杂化水凝胶固定化双酶级联反应器；所述底物包括葡萄糖、乙酰丙酮。

12、可选地，所述杂化水凝胶的形成包括以下步骤：

13、葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成h2o2，再将h2o2传递给hrp，从而hrp催化acac产生acac自由基；acac自由基与水溶性单体与交联剂发生自由基共聚合形成杂化水凝胶三维交联网络结构。

14、可选地，所述交联剂包括改性二氧化硅纳米粒子、n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的任意一种。

15、可选地，所述固定化双酶zif-8复合物与所述单体的质量比1：(10-100)。

16、可选地，所述交联剂的质量为单体质量的1％-4％。

17、可选地，所述葡萄糖在水中的浓度为5-20mmol/l。

18、可选地，所述乙酰丙酮在水中的浓度为0.1-1mmol/l。

19、可选地，所述组合酶的催化下的条件包括：温度为30℃。

20、第三方面，本发明提供一种杂化水凝胶固定化双酶级联反应器在废水处理中的应用，所述应用包括降解废水中的酚类化合物。

21、可选地，所述酚类化合物包括苯酚、双酚a、4-氯苯酚、阿魏酸、咖啡酸中至少一种。

22、可选地，所述杂化水凝胶固定化双酶级联反应器具有良好的重复使用性；重复使用5次后，所述级联反应器的相对于第一次使用的活性下降至20％。

23、本发明具备的有益效果包括：

24、(1)本发明提供的级联反应器的制备方法，通过仿生矿化法以zif-8包埋双酶，能够实现酶比例可控的高效固定化，且能有效保留双酶活性；且本发明外层的杂化水凝胶，通过固定化双酶本身的级联反应来酶催化水溶性单体聚合原位构建的，不需要严苛的反应条件和外加的反应试剂，在酶催化聚合过程中同时实现了杂化水凝胶网络的构建和固定化双酶的原位无损害包埋，避免了常规自由基聚合反应体系易导致酶构型变化甚至活性降低的问题，方法简单，条件温和，易于实现；

25、(2)本发明提供的杂化水凝胶，使用zif-8和kh570-sio2纳米粒子改善杂化水凝胶的交联密度和网络结构，有效地提升杂化水凝胶的机械强度，且能够提升包埋在其中的zif-8的结构稳定性，解决其在酸性溶液中易降解导致固定化酶泄露的问题，同时为固定化双酶提供亲水微环境，提升双酶级联反应的活性；

26、(3)本发明提供的杂化水凝胶固定化双酶级联反应器能有效地富集水中的酚类化合物，从而提高酚类化合物在固定化双酶附近的局部浓度，提升双酶级联反应催化降解酚类化合物的效率，具有高效性和环境友好性，对酚类化合物有很好的降解效果，且其产物无毒或低毒，符合绿色化学理念，可应用于含酚类化合物废水的高效处理。

1.一种杂化水凝胶固定化双酶级联反应器，其特征在于，所述杂化水凝胶固定化双酶级联反应器中包括反应核及所述反应核表面的杂化水凝胶层；

2.根据权利要求1所述的杂化水凝胶固定化双酶级联反应器，其特征在于，所述组合酶包括葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶、吡喃糖氧化酶/辣根过氧化物酶中任意一种。

3.根据权利要求1所述的杂化水凝胶固定化双酶级联反应器，其特征在于，所述杂化水凝胶层包括单体自由基聚合物。

4.根据权利要求3所述的杂化水凝胶固定化双酶级联反应器，其特征在于，所述单体包括水溶性单体；所述水溶性单体包括n,n-二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇丙烯酸酯、丙烯酸羟乙酯中任意一种。

5.一种如权利要求1-4任一项所述杂化水凝胶固定化双酶级联反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括改性二氧化硅纳米粒子、n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的任意一种。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述固定化双酶zif-8复合物与所述单体水溶液中的单体的质量比1：(10-100)。

8.一种如权利要求1-4任一项所述杂化水凝胶固定化双酶级联反应器在废水处理中的应用，其特征在于，所述应用包括降解所述废水中的酚类化合物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酚类化合物包括苯酚、双酚a、4-氯苯酚、阿魏酸、咖啡酸中至少一种。