一种基于RT-LAMP-Cas14a无PAM限制的水产神经坏死病毒检测方法

本发明属于重要水产病毒检测领域，具体涉及一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法。

背景技术：

0、技术背景

1、神经坏死病毒(nnv)属于nodaviridae科betanodavirus属，主要存在于受感染鱼类的脑细胞和视网膜细胞的细胞质中。它是一个无包膜的十二面体，直径约为25-34nm，含有两条单链rna分子，即rna 1(3.1kb)和rna2(1.4kb)。nnv可感染40多种鱼类，包括鲈形目、褶形目和鳕形目等。nnv对感染鱼类的致死率极高，主要表现为厌食、活力下降、常侧卧在水下不游动、下颌和尾鳍红肿溃烂，发病后鱼口大张。目前，nnv的防御和控制方法主要有两种：1)通过物理或化学方法进行消毒和灭活；2)使用疫苗(如灭活疫苗、蛋白疫苗和dna疫苗)进行预防和控制。遗憾的是，目前还没有有效的鱼类nnv治疗方法。因此，必须开发一种敏感而特异的诊断方法，以便及时有效地控制nnv的传播。

2、目前已报道的nnv检测方法多种多样，包括传统的细胞培养和电子显微镜、基于抗体的荧光免疫技术以及基于核酸的聚合酶链反应(pcr)、定量聚合酶链反应(qpcr)。然而，这些方法也存在一个或多个显著缺陷，如耗时长、成本高、依赖专业技术人员和灵敏度低。基于crispr-cas(簇状规则间隔短回文重复序列及相关蛋白)的诊断系统为病原体检测提供了一个新生平台。crispr-cas系统由cas内切酶和单链向导rna(sgrna)组成。cas内切酶在sgrna的引导下识别目标，并激活其反式裂解能力，非特异性地裂解单链dna(ssdna)[25-27]。核酸预扩增与crispr-cas系统相结合，可显著提高检测的灵敏度和特异性。cas14a对ssdna的结合和裂解(顺式或反式裂解)以及对pam依赖性(tttg/a)双链dna(dsdna)的顺式裂解活性均依赖于原位相邻基序(pam)，然而，许多病毒如神经坏死病毒的相关序列则不含pam序列，则限制了相关病毒的检测。

技术实现思路

1、本发明利用rt-lamp与cas14a结合开发出一种高灵敏高特异性的病毒检测技术，突破了无pam位点病毒的检测方法限制，可有效切断病毒传播，减少经济损失，具有广阔的应用前景。

2、针对上述问题，本发明目的在于提供一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法。该方法通过在rt-lamp引物组中添加pam序列，通过60℃恒温扩增，使目的片段含有pam位点，并与crispr-cas14a联合开发的新型无pam依赖的神经坏死病毒检测技术。

3、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、根据磁珠法操作步骤提取石斑鱼神经坏死病毒rna，得到待检测rna。

5、设计并合成rt-lamp引物组，序列如下：

6、fip-pam：5’-gacgctgctcctttcccac-ttta-gaacagtccgaccccagt-3’

7、bip：5’-ggagtgttcgattgagcgtttgccgacacacaggagt-3’

8、f3：5’-agtcgttgccaaatggtgg-3’

9、b3：5’-gcggtagtctcttcaggtgt-3’

10、lf：5’-cagaggagcgtgcgggtg-3’

11、lb：5’-gatgtggtcaacgtgtcag-3’

12、所述rt-lamp反应体系如下：

13、

14、所述rt-lamp扩增条件为：60℃，45min。

15、rt-lamp扩增产物琼脂糖凝胶电泳：取5μl产物，用2％琼脂糖凝胶电泳分析，有阶梯状条带的判断为阳性，无条带的为阴性。

16、根据t7 rna聚合酶体外转录试剂盒制备sgrna。

17、以rt-lamp扩增产物为待检测样，使用crispr-cas14a反应体系进行检测。

18、所述的crispr-cas14a反应步骤为：2μm cas14a，1μm sgrna and 2mm buffer(20mm tris-hcl,20mm nacl,ph 9.0)，37℃孵育20分钟，然后加入30mm mgcl2,500mmssdna探针,5μl rt-lamp扩增产物，37℃反应2h，并通过biotek h1酶标仪监测荧光信号(λex:492nm；λem:520nm)。

19、使用分子生物级别的无核酶水作为待测样本空白对照。

20、使用未感染神经坏死病毒的鱼作为待测样本阴性对照。

21、所述特异性检测样本为：大肠杆菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和伤寒沙门氏菌。

22、所述灵敏度检测方法：将108-101am神经坏死病毒rna以10倍梯度进行稀释后进行rt-lamp-cas14a检测。

23、本发明利用一步法rt-lamp扩增神经坏死病毒rna，不需要先将其转录为cdna再进行扩增，大大降低了操作难度。因神经坏死病毒其相关序列不具有pam序列，限制了构建cas14检测技术对其进行检测的可能性，本发明通过对rt-lamp引物进行设计，使其突破了pam序列的限制，并充分利用了cas14a酶的特性，提高了神经坏死病毒检测的灵敏度和特异性。

1.一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于，设计的rt-lamp引物组可在等温扩增后引入pam序列，含pam位点的扩增产物可被cas14a和sgrna复合物特异性识别，并激活cas14的反式切割活性，非特性切割ssdna报告探针进而得到可视化检测信号。

2.权利要1所述的一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于：包括一对内引物fip-pam和bip，一对外引物f3和b3，一对环状引物lf和lb，所述内引物序列为：

3.权利要1所述的一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于，所述sgrna序列为：gaacaguccgaccccaguac。

4.权利要1所述的一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于，所述ssdna序列为：5’6-fam-tttttttttttt-3’bhq1。

5.权利要1所述的一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：