一种改善老龄卵母细胞质量的培养液

本发明属于生物医药，涉及一种改善老龄卵母细胞质量的培养液。

背景技术：

1、组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tpa)在体内多种器官和组织中大量表达，是纤维蛋白溶解途径的关键酶，经纤溶酶进行蛋白水解加工，产生异二聚体丝氨酸蛋白酶。该蛋白酶裂解酶原以产生纤溶酶，纤溶酶是分解纤维蛋白凝块所需的蛋白酶。因为这样的特性，它是目前唯一获美国食品药品监督管理局批准的治疗因脑动脉阻塞引起的缺血性中风的药物，已被临床上广泛使用。此外，tpa还参与其他生物过程，例如突触可塑性、细胞迁移和组织重塑等。目前已有工作证明通过添加外源性tpa可以促进神经细胞的生长(参见：lee,s.h.et al.tpa regulates neurite outgrowth byphosphorylation of lrp5/6in neural progenitor cells.molecular neurobiology49,199–215(2014))，最近的工作又表明，向培养基中添加适量tpa可改善皮质酮诱导的小鼠壁颗粒细胞和输卵管上皮细胞的凋亡(参见：hua,q.et al.role of tpa incorticosterone-induced apoptosis of mouse mural granulosa and oviductalepithelial cells.cells 12,455(2023))。

2、卵母细胞质量下降是雌性生殖衰老的一个重要特征，也是导致高龄女性生育力下降的主要原因之一。已有诸多文献报道，在女性35岁以后，卵母细胞质量开始急剧下降，其特征是非整倍体增加、氧化应激增加、线粒体质量下降、凋亡水平和脂质过氧化水平升高等，可能导致女性的不孕、自然流产、胚胎阻滞等不良后果。目前，由于社会经济发展等复杂因素，女性生育延迟已成为重要趋势，因此改善老龄引起的卵母细胞质量下降，已成为维持高龄女性生育能力的重要举措。

3、但当前，改善老龄卵母细胞质量的方法仍然很有限，目前市面上还没有专门用于老龄卵母细胞体外成熟的培养液，况且其安全性仍然没有得到充分证明，因此这些研究没有能得到大规模的应用。因此，如研究一款更为安全的、老龄卵母细胞专用的培养液，将对有生育意愿但促排卵困难的高龄女性有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种更为安全的改善老龄卵母细胞质量的培养液，该培养液能应用于30岁以上女性或8月龄以上雌性小鼠来源的卵母细胞，可显著改善老龄卵母细胞的质量。

2、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

3、一种体外改善老龄卵母细胞质量的培养液，含有终浓度为5-100nm的组织型纤溶酶原激活剂。

4、作为本发明的一种优选，所述的培养液中组织型纤溶酶原激活剂的终浓度为50nm。

5、作为本发明的进一步优选，所述组织型纤溶酶原激活剂是人或小鼠来源的有活性的组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白。

6、作为本发明的一种优选，老龄卵母细胞来源于人或小鼠的任意一种。

7、作为本发明的进一步优选，老龄卵母细胞来源于30岁以上的人类女性或8月龄以上的雌性小鼠。

8、作为本发明的一种优选，所述培养液以m2培养液、m16培养液、g-1tm plus、czb培养液中的任意一种为基础培养液添加组织型纤溶酶原激活剂的浓储液所得。

9、作为本发明的一种优选，所述的组织型纤溶酶原激活剂的浓储液是将tpa溶解于含有载体蛋白的缓冲液配制。

10、作为本发明的进一步优选，所述的组织型纤溶酶原激活剂的浓储液的浓度为100μg/ml-500μg/ml。

11、作为本发明的进一步优选，所述载体蛋白为0.1％牛血清白蛋白、5％人血清白蛋白、10％胎牛血清或5％海藻糖，优选0.1％牛血清白蛋白。

12、作为本发明的进一步优选，所述缓冲液为无菌水或磷酸盐缓冲液；优选磷酸盐缓冲液。

13、组织型纤溶酶原激活剂在制备体外改善老龄卵母细胞质量的试剂中的应用。

14、有益效果：

15、本发明生物学实验结果显示：①经过本培养液培养16小时后，12月龄小鼠的卵母细胞第一极体排出率显著升高，表明本发明能够显著提高老龄小鼠卵母细胞的体外成熟率。②经过本培养液培养48小时后，12月龄小鼠的卵母细胞的碎裂率发生了明显的下降，表明本发明能够降低老龄小鼠卵母细胞的死亡率。③通过细胞凋亡检测试剂盒检查12月龄小鼠卵母细胞的凋亡水平，在共聚焦荧光显微镜下成像发现，本发明能够有效减少老龄小鼠卵母细胞的凋亡水平。④通过细胞脂质过氧化探针检查12月龄小鼠卵母细胞的脂质过氧化水平，在共聚焦荧光显微镜下成像发现，本发明能够有效减少老龄小鼠卵母细胞的脂质过氧化水平。⑤通过线粒体膜电位分析试剂盒检查12月龄小鼠卵母细胞的线粒体膜电位，在共聚焦荧光显微镜下成像发现，本发明能够有效恢复老龄小鼠卵母细胞线粒体的膜电位，提高线粒体质量。⑥通过线粒体深红荧光探针检查12月龄小鼠卵母细胞的线粒体细胞内分布情况，在共聚焦荧光显微镜下成像发现，本发明能够有效恢复老龄小鼠卵母细胞线粒体的正常均匀分布。通过线粒体膜电位分析试剂盒检查12月龄小鼠卵母细胞的线粒体膜电位，在共聚焦荧光显微镜下成像发现，本发明能够有效恢复老龄小鼠卵母细胞线粒体的膜电位，提高线粒体质量。⑦通过活性氧荧光检测12月龄小鼠卵母细胞的活性氧积累情况，发现本发明能有效降低老龄小鼠卵母细胞的活性氧水平。⑧通过微管蛋白染色检查12月龄小鼠卵母细胞的纺锤体组装情况，在共聚焦荧光显微镜下成像发现，本发明能够有效降低老龄小鼠卵母细胞纺锤体异常发生率。

1.一种体外改善老龄卵母细胞质量的培养液，其特征在于，含有终浓度为5-100nm的组织型纤溶酶原激活剂。

2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述的培养液中组织型纤溶酶原激活剂的终浓度浓度为50nm。

3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述组织型纤溶酶原激活剂是人或小鼠来源的有活性的组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白。

4.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：老龄卵母细胞来源于人或小鼠的任意一种。

5.根据权利要求4所述的培养液，其特征在于：老龄卵母细胞来源于30岁以上的人类女性或8月龄以上的雌性小鼠。

6.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述培养液以m2培养液、m16培养液、g-1tm plus、czb培养液中的任意一种为基础培养液添加组织型纤溶酶原激活剂的浓储液所得。

7.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于：所述的组织型纤溶酶原激活剂的浓储液是将tpa溶解于含有载体蛋白的缓冲液配制。

8.根据权利要求7所述的培养液，其特征在于：所述载体蛋白为0.1％牛血清白蛋白、5％人血清白蛋白、10％胎牛血清或5％海藻糖，优选0.1％牛血清白蛋白。

9.根据权利要求7所述的培养液，其特征在于：所述缓冲液为无菌水或磷酸盐缓冲液；优选磷酸盐缓冲液。

10.组织型纤溶酶原激活剂在制备体外改善老龄卵母细胞质量的试剂中的应用。