检测RHO基因多态性的组合物的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及rho基因的6个错义突变位点(c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a)的联检并进行区分的组合物、方法和用途。

背景技术：

1、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，rp)是一种遗传性视网膜神经退行性疾病，以进行性感光细胞死亡和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,rpe)细胞萎缩为特征，最初表现为夜盲、管状视野、视网膜色素沉积，一般视杆细胞先受累，进而引起视锥细胞退化，最终可导致病人失明。

2、rp是人类遗传性失明的主要原因，全球rp患病率为1/7000-1/3000，中国约为1/4000。该病发病原因复杂，rp具有高度的遗传异质性，遗传上已经发现90多个致病基因，rp遗传方式复杂，主要包括常染色体显性遗传(autosomal dominant retinitispigmentosa，adrp，占rp的30-40％)，常染色体隐性遗传(autosomal recessive retinitispigmentosa，arrp，占rp的50-60％)，x连锁隐性遗传(x-linked retinitis pigmentosa，xlrp，占rp的5-15％)，以及发病率低的双基因遗传和线粒体遗传。

3、常染色体显性遗传adrp的主要致病基因有rho，prpf31，rp1等，其中rho致病率最高，占adrp的26％。rho基因突变被认为是以常染色体显性方式遗传的rp的致病基因；研究表明，rho编码视紫红质；视紫红质是视杆细胞的视色素，通过改变环磷酸鸟苷的浓度调控细胞的膜电位，产生电信号，并通过视神经传递到视皮层形成视觉。大多数rho突变会导致紫红蛋白在感光细胞中高水平表达，使得大量的突变蛋白在细胞中定位异常并聚集，造成感光细胞凋亡，不能行使正常的光信号传导功能，阻碍光信号的传导，最终导致失明。这些研究表明，rho在维持眼睛感光细胞的信号转导过程发挥了重要作用。rho基因的错义突变，导致感光细胞凋亡，影响其正常的光转导功能，最终导致眼部失明的发生。

4、因此，本领域需求一种能够在早期快速、准确地检测rho基因的错义突变的产品和方法，助力视网膜色素变性的早期干预。

技术实现思路

1、有鉴于此，选择了rho基因的6个错义突变位点(c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a)，建立了基于飞行时间质谱(mald1-tof-ms)技术的单一反应检测这6个突变位点的高通量检测。

2、第一方面，本发明提供一种检测rho基因多态性位点的组合物，包括：

3、第一核酸组合物：

4、如seq id no:1～2所示的检测c.50c＞t的上下游引物；

5、如seq id no:1～2所示的检测c.68c＞a的上下游引物；

6、如seq id no:5～6所示的检测c.151g＞c的上下游引物；

7、如seq id no:8～9所示的检测c.310g＞a的上下游引物；

8、如seq id no:11～12所示的检测c.403c＞t的上下游引物；以及

9、如seq id no:14～15所示的检测c.647t＞a的上下游引物；和

10、第二核酸组合物：

11、如seq id no:3所示的检测c.50c＞t的单碱基延伸引物；

12、如seq id no:4所示的检测c.68c＞a的单碱基延伸引物；

13、如seq id no:7所示的检测c.151g＞c的单碱基延伸引物；

14、如seq id no:10所示的检测c.310g＞a的单碱基延伸引物；

15、如seq id no:13所示的检测c.403c＞t的单碱基延伸引物；以及

16、如seq id no:16所示的检测c.647t＞a的单碱基延伸引物。

17、进一步地，所述第一核酸组合物进行多重pcr反应，所述第二核酸组合物进行单碱基延伸反应。

18、在本发明中，rho基因的genebank登录号为nm_000539.3。

19、本发明采用多重pcr技术及核酸质谱。在一管反应液中能同时检测rho基因的6个错义突变位点c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a。一个样本，只需进行一次核酸提取和单管pcr扩增，所需样本量低，灵敏度和准确度高，检出限低，能够及时、有效地检测rho基因突变，辅助视网膜色素变性早期干预。

20、进一步地，所述组合物包括检测内标的上下游引物和单碱基延伸引物。

21、在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。

22、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物对和单碱基延伸引物中的一组或多组。在本发明中，“组”是指检测一个靶点的互相匹配的上下游引物和单碱基延伸引物。

23、本发明的组合物可以任意组合成检测对应6个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物对和单碱基延伸引物进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

24、举例来说，6组引物中的任意5组，6组引物中的任意4组，6组引物中的任意3组，6组引物中的任意2组，6组引物中的任意1组。

25、在一个具体的实施方案中，本发明的所述第一核酸组合物组合物的各成分存在于一个包装中；所述第二核酸组合物组合物的各成分存在于另一个包装中。

26、进一步地，本发明的所述包装的各成分以混合的形式存在。

27、第二方面，本发明提供了上述本发明检测rho基因多态性位点的组合物在制备检测视网膜色素变性的试剂盒中的用途，其中，所述6个错义突变位点是c.50c＞t、c.68c＞a、c.151g＞c、c.310g＞a、c.403c＞t、c.647t＞a。

28、第三方面，本发明提供了一种检测rho基因多态性位点的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

29、进一步地，所述试剂盒还包括dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

30、更进一步地，所述试剂盒还包括sap酶、sap缓冲液中的至少一种。

31、更进一步地，所述试剂盒还包括单碱基延伸反应酶、单碱基延伸缓冲液、以及单碱基延伸终止液中的至少一种。

32、进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。

33、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

34、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是rho基因的野生型和突变型克隆质粒。

35、进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂。

36、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：taq酶、sap酶、单碱基延伸反应酶、mg2+、dntps、引物、pcr缓冲液、sap缓冲液、单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸终止液，所述引物包括上下游引物和单碱基延伸引物。

37、在一个具体的实施方案中，单个pcr反应管中反应物总体积为8-18μl。

38、第四方面，本发明提供了一种组合物制备检测rho基因多态性位点的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：

39、1)提取或释放待测样本的核酸；

40、2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行pcr扩增；

41、3)对步骤2)所获得的产物进行sap反应；

42、4)对步骤3)所获得的产物进行单碱基延伸反应；

43、5)获得并分析结果。

44、在本发明中，用于检测的样本可以是血清、血液等，但不限于此。

45、进一步地，所述pcr的反应条件为：

46、预变性，温度为95℃，时间为120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为30秒，退火，温度为56℃，时间为30秒，延伸，72℃，时间为1分钟，45次循环，最后继续72℃延伸5分钟，1次循环。

47、进一步地，所述sap反应条件为：37℃40分钟，85℃5分钟。

48、进一步地，所述单碱基延伸反应条件为：95℃30s，(95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5次循环)40次循环，72℃3分钟。

49、第五方面，本发明提供了一种以非诊断目的检测rho基因多态性位点的方法，所述方法包括以下步骤：

50、1)提取或释放待测样本的核酸；

51、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行pcr扩增；

52、3)对步骤2)所获得的产物进行sap反应；

53、4)对步骤3)所获得的产物进行单碱基延伸反应；

54、5)获得并分析结果。

55、进一步地，所述pcr的反应条件为：

56、预变性，温度为95℃，时间为120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为30秒，退火，温度为56℃，时间为30秒，延伸，72℃，时间为1分钟，45次循环，最后继续72℃延伸5分钟，一次循环。

57、进一步地，所述sap反应条件为：37℃40分钟，85℃5分钟。

58、进一步地，所述单碱基延伸反应条件为：95℃30s，(95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5次循环)40次循环，72℃3分钟。