一种样本保存液及获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法

本发明涉及细胞培养，尤其涉及一种样本保存液及获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法。

背景技术：

1、猪耳缘成纤维细胞分离培养的意义在于建立珍贵品种猪的体细胞资源库，实现遗传材料的长久保存，并在需要时进行医学实验或活体复原。在进行分离培养时，首先需要采集猪的耳缘组织，经过消毒清洗后，将组织置于样本保存液中，在低温条件下运输回实验室。于超净台内将耳缘组织消毒清洗，分离皮肤组织并保留真皮层。将真皮层剪碎均匀铺在细胞培养皿中，通过添加含有血清的培养基，在37℃，5％co2培养条件下，组织块可以黏附在培养皿中并长久保持活性，新生的成纤维细胞可以从贴壁的组织块附近游出并生长。为了保持细胞基因组的稳定性，防止细胞老化，使用细胞冷冻保存液重悬细胞，此时细胞内代谢活动停滞进入休眠状态，可长期保存，并在需要时进行复苏。因此，样本组织的活性，分离细胞的方法，冷冻液的配比和细胞复苏的条件均是获得优质细胞的关键因素。

2、目前常用的猪耳缘组织样本保存液多以生理盐水和dpbs为主，样本组织的活性维持时间短，通常采集后需要在短时间内进行细胞分离培养。并且，已经建立的猪耳缘成纤维细胞分离培养体系的细胞污染率较高，成纤维细胞的产量和活率均较低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种样本保存液及获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，样本保存液可以使组织保持较高的活性，延长保存时间达到7天以上，7天内随时可分离得到大量优质的耳缘成纤维细胞。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种样本保存液，所述样本保存液由10ml dmem、500μl血清和100μl100×青霉素-链霉素-两性霉素组成。

4、本发明还提供了一种利用上述样本保存液获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，包括如下步骤：

5、(1)组织采样：选择耳朵部位较薄且避开大血管的地方消毒，用耳号钳在猪耳缘处取大约半个指甲盖大小的样本至样本保存液中，并转移至圈舍外；将采集的样本上较长的毛清理干净并消毒，消毒后用杜氏磷酸盐溶液将酒精冲洗干净，而后转移至杜氏培养液中，得到耳组织样本，4℃保存；

6、(2)原代细胞分离培养：将步骤(1)的耳组织样本剪碎至面积小于1mm2，得到组织块，将组织块转移至细胞培养皿中，使其均匀分布于皿底，细胞培养皿倒置培养，待组织块贴壁后，正置细胞培养皿加入杜氏培养液培养；

7、(3)传代培养：将步骤(2)原代细胞中的组织块剔除，清洗、消化，待细胞变圆并大部分脱壁后，杜氏培养液终止消化，离心、重悬、接种、继续传代培养，得到猪耳缘成纤维细胞；

8、(4)冷冻：将细胞培养皿中的旧培养液弃去，洗涤、消化，杜氏培养液终止消化后离心，加入冷冻液重悬猪耳缘成纤维细胞，分装，于-80℃冰箱中冷冻，冷冻后转入氮罐中长期储存。

9、进一步的，步骤(2)所述原代细胞分离培养的温度为37℃，倒置培养时间为4h～6h。

10、进一步的，步骤(3)每次进行所述传代培养的条件为细胞混合度达到70％～90％，传代时细胞传代的比例为1:2。

11、进一步的，步骤(3)所述洗涤使用的溶液为杜氏磷酸盐溶液，所述消化使用的酶为胰酶。

12、进一步的，步骤(4)所述洗涤使用的溶液为杜氏磷酸盐溶液，所述消化使用的酶为胰酶。

13、进一步的，步骤(4)所述冷冻液中各成分的体积比为dmem:血清:dmso＝7:2:1。

14、本发明的有益效果：

15、(1)本发明制备了一种由10ml dmem、500μl血清和100μl 100×青霉素-链霉素-两性霉素组成的样本保存液，样本保存液中的血清能够为组织提供营养并维持稳定性，抗生素能够抑制细菌和真菌的繁殖。使用该样本保存液保存耳组织，可以使组织保持较高的活性，最长可维持组织活性7天之久，7天内随时可分离得到活性好，增殖速度正常的耳缘成纤维细胞。

16、(2)本发明选择耳朵部位较薄且避开大血管的地方进行消毒采样，随后转移样本至圈舍外进行后续处理，可以有效减少真菌及细菌对样本的污染，所用的样本保存液中的血清能够为组织提供营养并维持稳定性，抗生素能够抑制细菌和真菌的繁殖。在传代培养时，由于成纤维细胞依赖高密度生长，本发明还调整猪耳缘成纤维细胞传代比例为1：2，避免由于接种密度过低导致细胞过早老化现象的发生。并且，由于细胞密度过低达不到传代要求的细胞数量，而细胞密度过高，会导致细胞发生接触抑制反应，导致细胞凋亡率增加，本发明还限定密度达到70％～90％再传代培养。在冷冻保藏时加大冷冻液中血清的比例，更好地保存猪耳缘成纤维细胞。

1.一种样本保存液，其特征在于，所述样本保存液由10ml dmem、500μl血清和100μl100×青霉素-链霉素-两性霉素组成。

2.一种利用权利要求1所述样本保存液获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤(2)所述原代细胞分离培养的温度为37℃，倒置培养时间为4h～6h。

4.根据权利要求2所述获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤(3)每次进行所述传代培养的条件为细胞混合度达到70％～90％，传代时细胞传代的比例为1:2。

5.根据权利要求2所述获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤(3)所述洗涤使用的溶液为杜氏磷酸盐溶液，所述消化使用的酶为胰酶。

6.根据权利要求2所述获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤(4)所述洗涤使用的溶液为杜氏磷酸盐溶液，所述消化使用的酶为胰酶。

7.根据权利要求2所述获得大量优质猪耳缘成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤(4)所述冷冻液中各成分的体积比为dmem:血清:dmso＝7:2:1。