ALDH2稳定表达的细胞系、构建方法及应用

本发明涉及细胞系构建，具体涉及一种aldh2稳定表达的细胞系、构建方法及应用。

背景技术：

1、肺癌是指起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，近年来肺癌的治疗方式日益增多，其中放射治疗(简称放疗)为无可代替的有效手段，其通过促使肿瘤细胞dna结构断裂的直接作用及促使肿瘤细胞中的水分子形成自由基杀伤细胞的间接作用来实现清除肿瘤细胞的目的，然而肺癌放疗伴随而来的副作用也引起了人们的注意。放射性肺损伤(radiation induced lung injury，rili)属于该副作用之一，其发生率因诊断标准不同而有所差异，该情况一旦发生，将限制放疗的剂量，影响治疗效果，同时增加患者的经济和精神负担。因此，预防和治疗rili刻不容缓。

2、近年来越来越多的研究报道突变型aldh2会影响多种疾病的发生进展。例如心血管疾病、神经退行性病变、肝脏、肺部病变等疾病。在肺部疾病中，研究人员发现激动aldh2活性能够改善大鼠肺缺血再灌注损伤及空气栓塞诱导的肺损伤，减轻炎症反应及病理病变程度，也因此，研究人员对此展开了进一步的深入研究，然而目前来说，aldh2对rili的作用及其机制尚不明确，依旧是研发的难点所在。

3、此外，在探索aldh2对rili的作用及其机制过程中，需要aldh2的活性或者表达的增加或者降低以此来形成对比。此前大多数学者研究aldh2在某种疾病中的作用时常常采用激动剂或抑制剂以此来提高或者降低aldh2活性，申请人前期研究中也采用了此种做法，但实际应用中各品牌的激动剂和抑制剂效果参差不齐，且药物价格昂贵，不便反复重现实验结果，因此建立aldh2稳定表达的细胞系迫在眉睫，具有极为重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明所解决的技术问题在于提供一种aldh2稳定表达的细胞系，利于aldh2稳定过表达或低表达，从而实现aldh2的活性或者表达的增加或者降低以此来形成对比，以取代现有的激动剂和抑制剂的使用。

2、本发明所解决的技术问题之二在于提供一种aldh2稳定表达的细胞系的构建方法，其通过独特质粒的构建及靶点选择，结合独特的构建工序及参数控制，进而得到aldh2稳定表达的a549细胞系。

3、本发明所解决的技术问题之三在于提供所述的细胞系在aldh2改善放射性肺损伤药物的机制及相关药物中的应用。

4、本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

5、一种aldh2稳定表达的细胞系，包括aldh2过表达的细胞系及aldh2敲低细胞系；aldh2的核苷酸序列如seq id no:1所示；

6、其中aldh2过表达的细胞系包括核苷酸序列如seq id no:2所示的重组质粒ex-c0231-lv206；

7、其中aldh2敲低细胞系包括核苷酸序列如seq id no:3所示的重组质粒hsh095660-lvru6mp-e。

8、进一步地，所述细胞系为a549细胞系。

9、进一步地，重组质粒ex-c0231-lv206由aldh2基因与pez-lv206真核表达载体重组构建而成。

10、进一步地，重组质粒hsh095660-lvru6mp-e由aldh2基因与psi-lvru6mp真核表达载体重组构建而成，其短发卡shrna的核苷酸序列如seq id no:4所示。

11、进一步地，重组质粒ex-c0231-lv206、重组质粒hsh095660-lvru6mp-e均包括mcherry报告基因和puro抗性基因。

12、如上任一所述的aldh2稳定表达的细胞系的构建方法，其特征在于，包括：将重组质粒ex-c0231-lv206或重组质粒hsh095660-lvru6mp-e转染a549细胞；采用浓度为1.5～2.5μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，得到aldh2稳定过表达或敲低的细胞系。

13、进一步地，转染时采用脂质体法进行转染，转染效率≥90％。

14、进一步地，筛选时，转染后24～48h内采用1.5～2.5μg/ml的嘌呤霉素进行初步筛选；48h后每隔3～5天使用上一次嘌呤霉素的一半浓度继续对转染后的细胞进行筛选和扩增，至a549细胞的荧光表达为80～90％为止。

15、如上任一所述的细胞系在aldh2改善放射性肺损伤药物中的应用。

16、进一步地，所述射性肺损伤药物中，aldh2通过抑制ros和由tgf-β1/smad通路介导的emt减轻rili。

17、有益效果：本发明所述的一种aldh2稳定表达的细胞系，其通过重组质粒ex-c0231-lv206和重组质粒hsh095660-lvru6mp-e作为基因载体，转染细胞而得到aldh2稳定表达的细胞系，其能利于aldh2稳定过表达或低表达，从而实现aldh2的活性或者表达的增加或者降低以此来形成对比，可取代现有的激动剂和抑制剂的使用。

18、本发明所述的aldh2稳定表达的细胞系，采用的重组质粒ex-c0231-lv206和重组质粒hsh095660-lvru6mp-e均包括mcherry报告基因和puro抗性基因，mcherry报告基因促使转染成功后的细胞发出红色荧光，便于观察评估转染效率，为后续成功构建奠定基础，而puro抗性基因利于高效筛选。

19、本发明所述的aldh2稳定表达的细胞系的构建方法，其通过独特质粒的构建及靶点选择，结合独特的构建工序及参数，此外还通过报告基因加入，使转染效率高至90％且便于筛选，从而得到aldh2稳定表达的a549细胞系。

20、本发明所述的aldh2稳定表达的细胞系，其能很好的应用于aldh2改善放射性肺损伤药物及药物研究。并且本发明经过研究放射性肺损伤药物中aldh2通过抑制ros和由tgf-β1/smad通路介导的emt减轻rili。

1.一种aldh2稳定表达的细胞系，其特征在于，

2.根据利要求1所述的aldh2稳定表达的细胞系，其特征在于，所述细胞系为a549细胞系。

3.根据利要求2所述的aldh2稳定表达的细胞系，其特征在于，重组质粒ex-c0231-lv206由aldh2基因与pez-lv206真核表达载体重组构建而成。

4.根据利要求2所述的aldh2稳定表达的细胞系，其特征在于，重组质粒hsh095660-lvru6mp-e由aldh2基因与psi-lvru6mp真核表达载体重组构建而成，其短发卡shrna的核苷酸序列如seq id no:4所示。

5.根据利要求2所述的aldh2稳定表达的细胞系，其特征在于，重组质粒ex-c0231-lv206、重组质粒hsh095660-lvru6mp-e均包括mcherry报告基因和puro抗性基因。

6.如权利要求1～5任一所述的aldh2稳定表达的细胞系的构建方法，其特征在于，包括：将重组质粒ex-c0231-lv206或重组质粒hsh095660-lvru6mp-e转染a549细胞；采用浓度为1.5～2.5μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，得到aldh2稳定过表达或敲低的细胞系。

7.如权利要求6所述的aldh2稳定表达的细胞系的构建方法，其特征在于，转染时采用脂质体法进行转染，转染效率≥90％。

8.如权利要求6所述的aldh2稳定表达的细胞系的构建方法，其特征在于，筛选时，转染后24～48h内采用1.5～2.5μg/ml的嘌呤霉素进行初步筛选；48h后每隔3～5天使用上一次嘌呤霉素的一半浓度继续对转染后的细胞进行筛选和扩增，至a549细胞的荧光表达为80～90％为止。

9.如权利要求1～5任一所述的细胞系在aldh2改善放射性肺损伤药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述aldh2通过抑制ros和由tgf-β1/smad通路介导的emt减轻rili。