一种基于细胞爬片的荧光原位杂交方法

本发明涉及分子细胞遗传学领域，具体是一种利用细胞爬片和寡核苷酸探针进行荧光原位杂交反应系统的建立方法，旨在探究寡核苷酸在细胞中的定位，为相关领域的研究提供更为简便、经济且高效的实验手段。

背景技术：

1、传统的荧光原位杂交技术需要依赖价格昂贵的原位杂交盒和其他复杂耗材，且操作步骤繁琐，给实验人员带来了很大的不便。此外，高昂的实验成本也限制了该技术在广泛应用中的推广。因此，急需一种更为简便、经济且高效的荧光原位杂交方法，以满足相关领域研究的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于细胞爬片的荧光原位杂交方法，该方法利用简单设备即可实现寡核苷酸在细胞中的定位探究，无需特殊杂交盒设备和其他复杂耗材，大大降低了实验成本，简化了操作步骤，提高了实验效率。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种基于细胞爬片的荧光原位杂交方法，包括以下具体步骤：

4、步骤s1：

5、细胞接种：提前将细胞接种在已经铺有圆形玻片的12孔细胞板中；对于原代细胞，提前一天进行细胞分选，然后接种于12孔细胞板中；

6、步骤s2：

7、洗涤：次日，弃除细胞培养基，用0.1％ pbst缓慢洗涤3次，每次5分钟，以去除细胞表面的杂质和残留物；

8、步骤s3：

9、固定：加入4％ pfa固定30分钟，然后弃除4％ pfa，再用0.1％ pbst洗涤3次，每次5分钟，以固定细胞形态；

10、步骤s4：

11、通透：加入0.3％ triton x-100通透20分钟，然后弃除0.3％ triton x-100，再用0.1％ pbst洗涤3次，每次5分钟，以使探针能够顺利进入细胞内；

12、步骤s5：

13、预杂交：加入hyb-，在55℃下静置孵育5分钟，以去除细胞内的非特异性结合位点；

14、步骤s6：

15、杂交：弃除hyb-，加入hyb+，在55℃下静置孵育3小时，然后加入hyb+配制的探针，在55℃下静置孵育过夜，使探针与细胞内的目标序列特异性结合；

16、步骤s7：

17、洗涤与封闭

18、次日，回收探针，加入50％乙酰胺-2×ssct，在55℃下静置孵育30分钟，重复一次；再用2×ssct在55℃下静置孵育15分钟；加入0.2×ssct，在55℃下静置孵育30分钟，重复一次；

19、封闭：加入2％羊血清，室温封闭15分钟，以封闭非特异性结合位点；

20、步骤s8：

21、抗体孵育

22、一抗孵育：加入2％羊血清配制的一抗，在4℃摇床上以26rpm的速度孵育过夜；次日，提前将样本取出，平衡复温10分钟；

23、回收一抗：回收一抗后，用0.1％ pbst洗涤3次，每次10分钟；

24、二抗孵育：将相应宿主来源的荧光二抗原液、dapi和2％羊血清按照说明书要求比例进行稀释，混匀后加入样本孔中，室温避光摇床上以26rpm的速度孵育2小时；

25、步骤s9：

26、洗涤与封片：回收二抗后，用0.1％ pbst洗涤3次，每次10分钟；加入防淬灭剂进行封片，以保护样本并防止荧光淬灭；

27、步骤s10：

28、观察与分析：在荧光显微镜下进行不同倍数的观察，并进行图像采集和分析，以确定寡核苷酸在细胞中的定位。

29、与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：

30、1.降低成本：本发明无需使用价格昂贵的原位杂交盒和其他复杂耗材，大大降低了实验成本；

31、2.简化步骤：本发明的操作步骤相对简便，无需繁琐的实验步骤和复杂的设备支持，提高了实验效率；

32、3.提高准确性：通过优化实验条件，本发明能够更准确地探究寡核苷酸在细胞中的定位，为相关领域的研究提供有力支持。

1.一种基于细胞爬片的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括以下具体步骤：