一种测定重组人血管内皮抑制素生物学活性的方法与流程

本申请涉及生物医药，具体地，涉及一种测定重组人血管内皮抑制素生物学活性的方法。

背景技术：

1、重组人血管内皮抑制素是中国第一个抗血管生成靶向药，用于治疗初治或复治的ⅲ/ⅳ期非小细胞肺癌患者，显示出良好的疗效。而生物学活性是评价此类生物技术药物有效性的关键质量属性之一，是药物在临床前进行质量控制的重要指标。细胞测定试验一般能较好地反映生物制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性测定。

2、目前已有的重组人血管内皮抑制素生物学活性的测定方法是huvec细胞增殖抑制法，该方法采用原代huvec细胞作为效应细胞，细胞检测代次限定在5代以内。但是，与化学方法相比，生物活性测定方法因受生物因素的依赖表现为变异大的劣势；而与使用传代细胞相比较，使用原代细胞的方法变异更大。目前的重组人血管内皮抑制素生物学活性的测定方法的检测结果的稳定性较差。

技术实现思路

1、提供了本申请以解决现有技术中存在的上述缺陷。需要一种测定重组人血管内皮抑制素生物学活性的方法，基于特异性的s型曲线的抑制效果，能够利用相对生物学活性的方法，得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性，变异较小，检测结果稳定。

2、本申请的第一方面，提供了一种测定重组人血管内皮抑制素生物学活性的方法，所述方法包括：利用对l929细胞培养传代后的传代细胞作为效应细胞与待测重组人血管内皮抑制素进行混合培养；对混合培养后的细胞进行裂解，得到裂解液；对裂解液进行吸光度的测定，基于测定后的结果和人血管内皮抑制素标准品与效应细胞混合培养后的吸光度测定结果，利用相对生物学活性的方法，得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性。

3、本申请各个实施例提供的测定重组人血管内皮抑制素生物学活性的方法，利用重组人血管内皮抑制素可以抑制l929细胞培养传代后的传代细胞的增殖，且对l929细胞培养传代后的传代细胞具有专属抑制性，其抑制性的浓度-吸光度曲线为s型曲线，能够得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性，具有变异小的优势，且检测结果稳定可靠，实用性好。

1.一种测定重组人血管内皮抑制素生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括：利用对l929细胞培养传代后的传代细胞作为效应细胞与待测重组人血管内皮抑制素进行混合培养；对混合培养后的细胞进行裂解，得到裂解液；对裂解液进行吸光度的测定，基于测定后的结果和人血管内皮抑制素标准品与效应细胞混合培养后的吸光度测定结果，利用相对生物学活性的方法，得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，效应细胞与待测重组人血管内皮抑制素进行混合培养中，所述效应细胞数量的接种密度为5000~15000个/培养单元。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，效应细胞与待测重组人血管内皮抑制素进行混合培养中，培养孵育的时间为48~72小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用dmem培养基对l929细胞进行培养传代，所述dmem培养基含8-12%fbs、0.8-1.2%ps；培养传代的温度为30-40℃；在培养箱中进行培养传代，培养箱中的二氧化碳的质量分数为4-6%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，效应细胞与待测重组人血管内皮抑制素进行混合培养，还包括：获取待测重组人血管内皮抑制素配制的不同浓度的待测重组人血管内皮抑制素溶液；不同浓度的待测重组人血管内皮抑制素溶液分别和效应细胞进行培养，得到不同浓度待测重组人血管内皮抑制素溶液分别对应的培养后的培养物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对混合培养后的细胞进行裂解，得到细胞裂解液，包括：向不同浓度待测重组人血管内皮抑制素溶液分别对应的培养后的培养物中加入染色液，并在加入染色液后孵育；染色孵育后，加入裂解剂，进行裂解，得到不同浓度待测重组人血管内皮抑制素溶液分别对应的裂解液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，加入染色液后孵后培养孵育的时间为4-6h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对裂解液进行吸光度的测定，基于测定后的结果利用相对生物学活性的方法，得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性，包括：对不同浓度待测重组人血管内皮抑制素溶液对应的裂解液分别进行吸光度测定，得到吸光度-浓度曲线；基于所述吸光度-浓度曲线进行四参数曲线拟合，得到待测重组人血管内皮抑制素的剂量效应曲线；基于所述待测重组人血管内皮抑制素的剂量效应曲线和标准品对应的剂量效应曲线，利用相对生物学活性的方法，得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性。

9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，基于所述待测重组人血管内皮抑制素的剂量效应曲线和标准品对应的剂量效应曲线，利用相对生物学活性的方法，得到待测重组人血管内皮抑制素的生物学活性，包括，通过式（1）计算得到相对生物学活性，

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，待测重组人血管内皮抑制素配制的不同浓度的待测重组人血管内皮抑制素溶液的数量为8-10个。