基于CRISPR/Cas12a和逻辑门的甲流和乙流信号分析系统

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种基于逻辑门的甲流和乙流信号分析系统。

背景技术：

1、逻辑门是一种二进制电路，可有效区分多个信号，使其成为分析复杂样品的宝贵工具。在过去的几年里，通过在分子尺度上实现布尔运算而提供无与伦比的优势的分子逻辑门逐渐取代了传统的硅基电子计算机。迄今为止，dna生物计算系统已经成功制造出来，可以执行基本、高级和复杂的逻辑功能，例如键盘锁、编码器、解码器、加法器和减法器。尽管取得了巨大的进步，但它们中的大多数在实际应用中还有待发展。例如在构建逻辑门传感平台用于病毒检测方面，chen等人开发了四面体的动态网络及逻辑门用于covid-19或其他冠状病毒诊断检测。zuo等人开发了基于逻辑门和分散到定位催化发夹组装的双片段触发dna梯纳米结构，用于sars-cov-2和h1n1的荧光检测。song等人构建基于or逻辑门的光电化学传感器用于高危人乳头瘤病毒的逻辑判别。虽然这些设计成功的用于靶标的检测，但是它们或需要设计复杂的纳米结构、或特殊的光电转导、或成本高昂和存在背景泄露。因此建立一种设计简单、低成本、特异性识别的病毒逻辑信号分析系统具有重要意义。

2、为了应对这一挑战，本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种基于crispr/cas12a和逻辑门的甲流和乙流信号分析系统。规则间隔的短回文重复序列(crispr)和crispr相关蛋白(cas)簇对靶向核酸序列具有高度特异性和模块化，是分子诊断的创新工具。尽管crispr平台在检测特异性和灵敏度方面具有强大的生物传感功能，但crispr/cas系统对报告基因的反式裂解是非特异性的，限制了多重靶标检测的应用。zhang等人筛选出对裂解基团具有不同偏好的cas效应子，但是正交cas效应子的可用性限制了复用到四个目标。另外一种可替代方法是将cas反应区室化并运行平行分析。pardis c.sabeti将液滴流体技术和crispr技术结合用于高通量的核酸检测。然而，该过程繁琐，并且需要复杂的工具来生成、合并和检测单个液滴。liu采用多个流式腔室来包含靶向特异性crispr/cas12a复合物。这些方法，需要对不同靶标设计不同的crrna,或者复杂的隔离装置，成本高昂，难以满足临床低成本的检测需求。布尔逻辑可以应用于表示为0(no)和1(yes)的任何类型的信息，被广泛用于实现这种定性分析。在过去的十年中，由于dna具有稳定性、可及性和可操作性等优势，大量的研究工作集中在设计和应用能够实现逻辑门控生物医学功能的基于dna逻辑门(dlg)的生物传感器上。逻辑门控的出现或许可以提高crispr/cas12a对多个靶标分析的能力。

3、本发明将crispr/cas12a系统与sda等温扩增和逻辑门耦联，实现了甲流和乙流病毒的逻辑识别。sda等温核酸扩增可提供高效的扩增，无需复杂的温度循环设备，具有极高的扩增效率。crispr/cas12a具有高度特异性和模块化，可以增强对靶标的识别。逻辑门可实现对甲流和乙流的逻辑信号分析。

技术实现思路

1、本发明的目的是开发出一种简单、通用、特异识别的病毒逻辑信号分析系统。

2、具体技术方案如下：

3、一种基于crispr/cas12a和逻辑门的甲流和乙流信号分析系统，其制备方法包括以下步骤：

4、(1)甲流和乙流rna序列转化初始阶段涉及bstni精确切割rna/dna异源双链体中的dna，以将甲流或乙流rna转化为短dna。将8ul的甲型/乙型流感病毒rna、8ul 10um的甲型/乙型流感病毒dna转化子于37摄氏度孵育10分钟。接着加入1.5ul 10×的nebuffer3.1、1.7ul 10u/ul的bstni和0.8ul的焦碳酸二乙酯(depc)处理水在55摄氏度反应10分钟，即可得到转化的启动子a/b。将以上转化的启动子a/b置于4摄氏度储存。

5、(2)输入链的制备利用制备的启动子用于链置换等温扩增(sda)产生下游逻辑门的输入链。将10ul的转化产物、1ul 10um的模板a/b、1ul 10×的bst dna polymerase、1ul10×的thermopol、1ul 10×的nt.bstnbi、1ul 10×的nebuffer r3.1、1ul 10mm的dntp和4ul的纯净水混合，在55摄氏度反应30分钟后在80摄氏度反应15min终止反应，即可得到输入链inputa/b。

6、(3)逻辑门的制备1.2ul 10um的crrna、1ul 10um的cas和22.8的depc水混合制备400n的crrna-cas复合物。and逻辑门门控体系中包含2ul 400nm的crrna-cas复合物、2ul10×的cutsmart缓冲液、1ul 5um的hex报告基因、2ul 10mm的dtt溶液和3ul的depc水。400nm的crrna-cas复合物、1um的or-pre-exsited-r以体积比2：1孵育10min制备预复合物1。400nm的crrna-cas复合物、1um的or-pre-exsited-l以体积比2：1孵育10min制备预复合物2。or逻辑门门控体系中包含1ul预复合物1、1ul预复合物2、2ul 10×的cutsmart缓冲液、1ul 5um的hex报告基因、2ul 10mm的dtt溶液和3ul的depc水。800nm的crrna-cas复合物、1um的nor-pre-exsited-l1、1um的nor-pre-exsited-r1以体积比2：1：1孵育10min制备预复合物3。800nm的crrna-cas复合物、1um的nor-pre-exsited-l2、1um的nor-pre-exsited-r2以体积比2：1：1孵育10min制备预复合物4。nor逻辑门门控体系中包含1ul预复合物3、1ul预复合物4、2ul 10×的cutsmart缓冲液、1ul 5um的hex报告基因、2ul 10mm的dtt溶液和3ul的depc水。这样就建立起基于逻辑门的甲流和乙流信号分析系统。

7、(4)信号输出将10ul的inputa/b与制备好的10ul的and、or、nor逻辑门门控体系溶液混合，于rotor荧光仪在37摄氏度反应1小时，在hex通道测荧光信号，即可对甲流和乙流进行逻辑信号分析。所述步骤(1)中在55摄氏度反应10分钟。

8、所述步骤(2)中在55摄氏度反应30分钟后在80摄氏度反应15min终止反应。

9、所述步骤(3)中crrna-cas复合物和or-pre-exsited-r的体积比是2：1并孵育10min制备预复合物1。400nm的crrna-cas复合物、1um的or-pre-exsited-l以体积比2：1并孵育10min制备预复合物2。crrna-cas复合物、nor-pre-exsited-l1、nor-pre-exsited-r1以体积比2：1：1孵育10min制备预复合物3。crrna-cas复合物、nor-pre-exsited-l2、nor-pre-exsited-r2以体积比2：1：1孵育10min制备预复合物4。

10、所述步骤(4)中在37摄氏度反应1小时。

11、本发明基于crispr/cas12a和逻辑门建立了甲流和乙流信号分析系统。其检测原理初始阶段涉及bstni精确切割rna/dna异源双链体中的dna，以将甲流或乙流rna转化为短dna用于sda等温扩增。不同的转换dna，它能与influenzaa和influenza b的rna序列杂交，从而形成具有bstni核酸内切酶识别位点的rna/dna异源双链体。在限制性内切酶的作用下，转化子dna会释放出一个短片段作为sda的启动子。随后启动子与相应的sda扩增模板杂交，表现出链置换活性的bst dna聚合酶促进链延伸。然后dsdna在这些切口位点被nt.bstnbi切割，释放出下游的输入链。输入链与设计好的crispr/cas12a门口反应，当甲流和乙流同时存在时，and门可输出逻辑信号。当甲流和乙流存在其一时，or门可输出逻辑信号。甲流和乙流都不存在时，nor门可输出逻辑信号。

12、逻辑门控的成功制备对该逻辑生物传感器起着至关重要的作用。我们首先利用合成好的输入链测试and、or、nor门控是否能产生正确的信号。如附图1所示，为and逻辑门信号输出时的荧光曲线图。当同时存在两个输入信号inputa和inputb才会产生荧光信号(曲线a)。当只存在inputa时，无荧光信号(曲线b)。当只存在inputb时，无荧光信号(曲线c)。当inputa和inputb都不存在时，无荧光信号(曲线d)。如附图2所示，为or逻辑门信号输出时的荧光曲线图。当同时存在两个输入信号inputa和inputb产生荧光信号(曲线a)。当只存在inputa时，产生荧光信号(曲线c)。当只存在inputb时，产生荧光信号(曲线b)。当inputa和inputb都不存在时，无荧光信号(曲线d)。如附图3所示，为nor逻辑门信号输出时的荧光曲线图。当同时存在两个输入信号inputa和inputb没有荧光信号(曲线c)。当只存在inputa时，无荧光信号(曲线b)。当只存在inputb时，无荧光信号(曲线d)。当inputa和inputb都不存在时，产生荧光信号(曲线a)。这些结果都表明成功构建了逻辑门控系统。

13、然后我们证明bstni可以精确切割rna/dna异源双链体中的dna，以将甲流或乙流rna转化为短dna。如附图4所示，page图展示了酶切的结果。泳道1是甲流rna，泳道2是甲流转换子convertora，泳道3是i甲流rna和convertora的复合物。泳道4是酶切后的条带，泳道5是其不添加酶的结果，泳道6是inititor-a对的照物。这些结果说明甲流rna成功转化出了dna启动子a。泳道7是乙rna，泳道8是转换子convertor b，泳道9是乙流rna和convertorb的复合物，泳道10是酶切后的产物，泳道11是不添加酶的产物，泳道12是inititor-b对的照物。这些结果说明乙流rna成功转化出了dna启动子b。

14、接着我们将上述转化的启动子用于sda扩增产生输入链。如附图5所示，展示了and和or逻辑门所需输入链产生的结果。泳道1是inititor-a，泳道2是模板a，泳道3是inititor-a和a模板a的复合物，泳道4是扩增阳性产生的结果，泳道5是扩增阴性，泳道6是input1的参照物。这些结果说明甲流转化出的启动子成功扩增出了输入链a。泳道7是inititor-b泳道8是模板b，泳道9是inititor-b和模板b的复合物，泳道10是扩增阳性产生的结果，泳道11是扩增阴性，泳道12是input2的参照物。这些结果说明乙流转化出的启动子成功扩增出了输入链b。如附图6所示，展示了nor逻辑门所需输入链产生的结果。泳道1是inititor-a，泳道2是模板a，泳道3是inititor-a和模板a的复合物，泳道4是扩增阳性的结果，泳道5是扩增阴性，泳道6是input1参照物。这些结果说明甲流转化出的启动子成功扩增出了输入链a。泳道7是inititor-b泳道8是模板b，泳道9是inititor-b和模板b的复合物，泳道10是扩增阳性产生的结果，泳道11是扩增阴性，泳道12是input2的参照物。这些结果说明乙流转化出的启动子成功扩增出了输入链b。

15、最后是信号的逻辑分析。我们将上述产生的输入链分别加入到逻辑门控体系中验证最终信号的输出。如附图7所示，为and逻辑门信号输出时的荧光条形图。当同时存在甲流和乙流时，经过转化、扩增、输入后产生了信号(条图c)。当只存在甲流时，无信号(条图a)。当只存在乙流时，无信号(条图b)。当不存在甲流和乙流时，无信号(条图d)。如附图8所示，为or逻辑门信号输出时的荧光条形图。当同时存在甲流和乙流时，经过转化、扩增、输入后产生了信号(条图a)。当只存在甲流时，有信号(条图b)。当只存在乙流时，有信号(条图c)。当不存在甲流和乙流时，无信号(条图d)。如附图9所示，为nor逻辑门信号输出时的荧光条形图。当同时存在甲流和乙流时，经过转化、扩增、输入后无信号(条图a)。当只存在甲流时，无信号(条图b)。当只存在乙流时，无信号(条图c)。当不存在甲流和乙流时，产生信号(条图d)。上述结果证明了crispr/cas12a逻辑门控系统分析甲流和乙流的可行性。

16、本发明将crispr/cas12a系统与sda等温扩增和逻辑门耦联，成功实现了甲流和乙流病毒的逻辑识别。bstni精确切割可以实现rna的转化，拓宽了靶标检测范围。sda等温核酸扩增可提供高效的扩增，无需复杂的温度循环设备，可实现靶标信号的放大。crispr/cas12a具有高度特异性识别能力，可以增强对靶标的识别，其模块化特性增加了与其他分子网络衔接的能力。逻辑门实现了对甲流和乙流的逻辑信号分析。同时，我们提出的这种检测策略，只需要改变转换子和扩增的模板，就可以实现其他核酸的检测。结果表明，该逻辑门生物传感器在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。