一种提高茎瘤固氮根瘤菌ORS571胞外多糖产量的培养基及其制备方法和应用

本发明属于微生物培养，具体涉及一种提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量的培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胞外多糖(exopolysaccharides，eps)是一类复杂的生物高分子化合物，是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。对微生物的生长有重要意义。不同的微生物胞外多糖有不同的特性和用途，自然界发现有100多种微生物产胞外多糖，主要是细菌，也有少数真菌。

2、茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobium caulinodans)ors571属于α-变形菌，最初由dreyfus等从热带豆科植物毛萼田菁(sesbania rostrata)的茎瘤中分离得到。其寄主植物非常有限，尽管能与多种田菁属植物共生结瘤，但只在s.rostrata上形成有效瘤。与其他根瘤菌一样，ors571通过固定大气中的游离氮为寄主提供氮素养料，从而减少寄主对土壤中氮肥的依赖。区别于其他根瘤菌的是，ors571能够同时在植物的根和茎上结瘤，既能与其天然宿主共生固氮，又能自生或作为内生菌在其他植物体内固氮。基于ors571既具有根瘤菌的共性又有自身固氮的特性，使其比其他根瘤菌更具有研究价值。

3、然而，茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量低，是制约其胞外多糖大规模生产的主要因素。胞外多糖的产量易受不同因素影响，与茎瘤固氮根瘤菌ors571遗传特性、培养条件等有关，且受到相关基因的调控。因此，提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量，对于细菌胞外多糖的大量生产尤为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量，制备纯度较高的茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量。

2、为了实现上述目的，本发明提供了钙离子在提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量中的应用。

3、本发明还提供了钙离子在制备提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量的培养基中的应用；

4、所述培养基中钙离子浓度为0.272～4.45mmol/l。

5、优选的，所述培养基中钙离子浓度为2.72mmol/l。

6、本发明还提供了一种提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量的培养基，所述培养基包括0.5％～1％d-l乳酸钠、5～10mmol/l k-pi缓冲液、0.1％v/v1000×mg-na-mo混合液、5～10mmol/lnh4cl，0.272～4.45mmol/l cacl2·2h2o、5.4mg/lfecl3·6h2o、0.1％v/v1000×维生素混合液和余量的水；

7、所述k-pi缓冲液包括0.615mol/lk2hpo4和0.3851mol/lkh2po4；

8、所述1000×mg-na-mo混合液包括：100g/lmgso4·7h2o、50g/lnacl和5g/lna2moo4·2h2o；

9、所述1000×维生素混合液包括2g/l生物素、4g/l烟酸和4g/l泛酸。

10、本发明还提供了上述技术方案所述培养基的制备方法，包括如下步骤：

11、将d-l乳酸钠、k-pi缓冲液、1000×mg-na-mo混合液、nh4cl和水混合后，灭菌，得到第一预混物；

12、将所述第一预混物、cacl2·2h2o、fecl3·6h2o和1000×维生素混合液混合，得到所述培养基。

13、本发明还提供上述技术方案所述培养基在制备茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖中的应用。

14、本发明还提供了一种茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：

15、将茎瘤固氮根瘤菌ors571接种至上述技术方案所述培养基中，30～37℃震荡培养，收集培养液；所述培养液中含有所述茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖。

16、优选的，所述震荡培养的转速为150～180rpm，时间为12～48h。

17、优选的，得到所述培养液后，还包括：对所述培养液进行浓缩，得到浓缩液；

18、对所述浓缩液进行醇沉提取，得到提取物；

19、对所述提取物进行纯化，得到纯化后的茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖。

20、优选的，所述纯化的步骤包括：利用木瓜蛋白酶酶解所述提取物，得到酶解产物；

21、所述酶解的温度为55～65℃，时间为12～48h；

22、对所述酶解产物进行醇沉，收集第一沉淀；

23、利用水复溶所述第一沉淀后调节ph至2.5，收集第二沉淀；

24、将所述第二沉淀和醋酸钾溶液混合，4℃静置，收集第三沉淀；所述醋酸钾溶液的溶剂为75％v/v乙醇溶液；

25、将所述第三沉淀浓缩，干燥，得到纯化后的茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖。

26、有益效果：

27、本发明提供了钙离子在提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量中的应用，钙离子作为第二信使调控茎瘤固氮根瘤菌ors571的多种生物过程，进而促进茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖的产生，提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖的产量。实施例结果表明，本发明利用含有钙离子的培养基对茎瘤固氮根瘤菌ors571进行发酵，能提高茎瘤固氮根瘤菌ors571产胞外多糖的含量，实施例结果表明，茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量到达0.424～0.567mg/ml，相比未添加钙离子的处理组，茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖含量显著提高，并且经纯化后，茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖纯度达到30～40％。

1.钙离子在提高茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobium caulinodans)ors571胞外多糖产量中的应用。

2.钙离子在制备提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量的培养基中的应用；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述培养基中钙离子浓度为2.72mmol/l。

4.一种提高茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖产量的培养基，其特征在于，所述培养基包括0.5％～1％d-l乳酸钠、5～10mmol/l k-pi缓冲液、0.1％v/v1000×mg-na-mo混合液、5～10mmol/lnh4cl、0.272～4.45mmol/l cacl2·2h2o、5.4mg/lfecl3·6h2o、0.1％v/v 1000×维生素混合液和余量的水；

5.权利要求4所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.权利要求4所述培养基或权利要求5所述的制备方法得到的培养基在制备茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖中的应用。

7.一种茎瘤固氮根瘤菌ors571胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述震荡培养的转速为150～180rpm，时间为12～48h。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，得到所述培养液后，还包括：对所述培养液进行浓缩，得到浓缩液；

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的步骤包括：利用木瓜蛋白酶酶解所述提取物，得到酶解产物；