F-box基因OsFBX49在水稻抗褐飞虱中的应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及f-box基因osfbx49在水稻抗褐飞虱中的应用。

背景技术：

1、水稻是最重要的粮食作物之一，世界上有超过一半的人以其为主食。同时，水稻生产直接关系到我国粮食安全、农民增收和农村稳定。褐飞虱是水稻生产中发生和为害面积最大的害虫。褐飞虱的成虫或若虫群集于稻丛基部，剌吸韧皮部的汁液，消耗稻株养分。当褐飞虱大爆发时，稻株下部变黑，瘫痪倒伏，稻田成片枯萎，减产甚至失收。据统计，2006-2015年这十年内，我国每年因褐飞虱危害，发生面积3.87亩次，损失稻谷120吨，占水稻各种病虫害总损失的29.5%，是我国水稻生产中的头号害虫（刘万才等，2016）。褐飞虱也是亚洲水稻生产中的头号害虫，常常使各国水稻损失惨重。尤其是进入21世纪之后，整个亚洲水稻产区褐飞虱爆发的频率和规模有逐渐扩大的趋势, 目前已经成为了水稻生产上最大的威胁，被认为是水稻的第一大害虫（heong & hardy, 2009; irri, annual report 2011）。因此，遏制褐飞虱的发展和危害，是保障水稻生产安全的重大需求。

2、f-box蛋白最初发现于细胞周期蛋白cyclinf中，是scf复合体中的关键因子（glickman m.h. et al.,2002; jain m., 2007），因其n端含有约40-50个氨基酸组成的f-box基序而被命名为f-box，这些位置由高度保守的leu-pro二肽和其他疏水或支链（val和ile）氨基酸的组合占据。f-box蛋白可以与scf泛素e3连接酶的核心亚基-s期激酶相关蛋白1（s-phase kinase-associated protein 1，skp1）相互作用形成scf复合体，参与植物生长发育、植物光形态建成、植物激素信号转导、抵抗生物胁迫等过程。f-box蛋白对植物的生长发育和逆境适应均至关重要，然而，对其在植物抗虫方面的功能研究很少。

技术实现思路

1、针对以上现有技术的不足，本发明提供水稻含f-box结构域蛋白基因osfbx49在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。

2、为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供f-box基因osfbx49在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，所述基因osfbx49的核苷酸序列为（i）或（ii）：

4、（i）seq id no.1所示的核苷酸序列，其orf全长1176 bp，编码391个氨基酸；

5、（ii）seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，且与seq id no.1所示的核苷酸序列表达相同蛋白质的核苷酸序列。

6、本领域技术人员应当理解根据seq id no. 1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在不同水稻背景下的序列，替换或者缺失一个或几个核苷酸，编码的氨基酸序列没有移码突变，仅仅出现部分氨基酸的缺失或者点突变。因此，本发明所述的基因osfbx49的核苷酸序列还包括seq idno. 1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，且与seq id no.1所示的核苷酸序列表达相同蛋白质的核苷酸序列。

7、进一步地，所述基因osfbx49编码如下蛋白质（a）或（b）：

8、（a）由seq id no. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

9、（b）seq id no. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且与seq id no. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的由（a）衍生的蛋白质。

10、本领域技术人员应当理解为，在不影响基因osfbx49编码的蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对seq id no. 2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

11、本发明提供的f-box基因osfbx49在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，所述基因osfbx49的活性和/或表达量增加，则水稻对褐飞虱的抗性增强，水稻对褐飞虱的抗性增强主要表现在：褐飞虱取食水稻叶鞘后，对照水稻植株死亡，而基因osfbx49超量表达的植株正常生长；同时，褐飞虱取食超量表达植株叶鞘后，褐飞虱的存活率降低，其体重的增重降低，分泌的蜜露量减少。

12、第二方面，本发明提供一种生物材料，其特征在于，所述生物材料含有基因osfbx49，所述生物材料为重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌；所述基因osfbx49的核苷酸序列为（i）或（ii）：

13、（i）seq id no.1所示的核苷酸序列；

14、（ii）seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，且与seq id no.1所示的核苷酸序列表达相同蛋白质的核苷酸序列。

15、第三方面，一种基因osfbx49，或权利要求3所述生物材料在选育具有抗褐飞虱性能的水稻品种中的应用，其特征在于，所述基因osfbx49的核苷酸序列为（i）或（ii）：

16、（i）seq id no.1所示的核苷酸序列；

17、（ii）seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，且与seq id no.1所示的核苷酸序列表达相同蛋白质的核苷酸序列。

18、第四方面，本发明提供一种增强水稻对褐飞虱抗性的方法，包括：利用基因工程手段，使osfbx49基因的活性和/或表达量增加。

19、进一步地，所述基因工程包括：构建osfbx49基因的超量表达载体，用该载体转化水稻。

20、更进一步地，所述超量表达载体采用常规生物技术方法导入植物细胞中，所述常规生物技术方法包括但不限于使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔。

21、更进一步地，所述超量表达载体采用农杆菌介导法导入植物细胞中，用于转化水稻。

22、第五方面，本发明提供采用所述方法获得的转基因水稻在水稻育种中的应用。

23、进一步地，所述育种的方法包括：转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

24、本发明所述osfbx49基因的发现与功能验证：

25、（1）发现过程：通过对抗、感褐飞虱水稻的转录组分析中，发现了一个抗褐飞虱水稻中受褐飞虱取食，上调表达的基因osfbx49。

26、（2）遗传转化验证功能：构建osfbx49基因超量表达载体，载体骨架是含有ubiquinti启动子的pcxun载体，采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超量表达载体导入感虫水稻中，筛选转基因植株，最后获得osfbx49基因超量表达的阳性转基因水稻植株；对t2代的植株进行了定量pcr分析，挑选2个具有代表性的相对表达量较高的株系（osfbx49-1、osfbx49-6）进行功能验证；对t2代的转基因植株进行抗虫鉴定，包括苗期集团法、存活率、虫增重和蜜露量等，发现这两个株系对褐飞虱的抗性显著增强。

27、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

28、本发明通过增加感虫水稻品种中osfbx49基因的表达，发现超量表达的转基因水稻植株抗虫性增强，本发明首次揭示了osfbx49基因增强了水稻对褐飞虱的抗性，可以用于植物抗虫反应的研究；植物细胞中的osfbx49基因成员很多，参与多种生物学功能，因此，本发明对osfbx49基因的研究对于后续研究其他的含f-box结构域蛋白成员具有很好的参考价值。