特异性结合MUC-1的抗体及其用途的制作方法

提供了用于预防和/或治疗癌症的抗muc1抗体、抗muc1/抗cd3双特异性抗体以及包含它们的药物组合物。

背景技术：

1、muc1(黏蛋白-1)是一种黏蛋白糖蛋白，并且是包含多个糖基化胞外结构域的跨膜糖蛋白。muc1在细胞表面上的长度为200nm至500nm，并且muc1位于正常上皮细胞的顶端膜中。muc1在许多器官如乳腺、胃、食管、胰腺、尿道、肺、肾和胆囊的腺或管腔上皮细胞中表达。黏蛋白在许多癌症类型中过表达，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等。已经对黏蛋白和癌症之间的病理关系进行了许多研究，特别是，本领域已知的几种针对muc1的抗体。

2、然而，它们的治疗效果仍可得到改善，因此，本技术提供了具有改善特性的抗muc1抗体或其抗原结合片段。

3、公开

4、技术问题

5、一方面提供了抗muc1抗体或其抗原结合片段。

6、另一方面提供了抗muc1/抗cd3双特异性抗体，其包含抗muc1抗体或其抗原结合片段，以及抗cd3抗体或其抗原结合片段。

7、其他方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含(i)抗muc1抗体或其抗原结合片段，或(ii)作为活性成分的抗muc1/抗cd3双特异性抗体。

8、其他方面提供了用于预防或治疗癌症的方法，包括向需要预防或治疗癌症的对象施用(i)抗muc1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗muc1/抗cd3双特异性抗体。

9、其他方面提供了(i)抗muc1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗muc1/抗cd3双特异性抗体用于预防或治疗癌症的用途，或其用于制备抗癌剂的用途。

10、其他方面提供了编码(i)抗muc1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗muc1/抗cd3双特异性抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体和/或包含该重组载体的重组细胞。

11、其他方面提供了用于制备(i)抗muc1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗muc1/抗cd3双特异性抗体的方法，包括施用表达编码(i)抗muc1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗muc1/抗cd3双特异性抗体的多核苷酸。

12、技术解决方案

13、术语的定义

14、当出于治疗目的将通过用所需抗原免疫被免疫动物而产生的动物源性抗体施用于人时，通常会引起免疫排斥，为了抑制这种免疫排斥，已经开发了嵌合抗体。嵌合抗体是一种引起抗同种型反应的动物源抗体的恒定区被人源抗体的恒定区取代的抗体。与动物源抗体相比，嵌合抗体显著提高了抗同种型应答，但是动物源氨基酸仍然存在于可变区，因此，具有抗独特型应答的潜在副作用。为改善这些副作用而开发的是人源化抗体。这是通过移植cdr(互补决定区)区域所制造的，其在嵌合抗体可变区中的抗原结合到人源抗体框架中起重要作用。

15、在一个具体实施方案中，抗muc1抗体可以是动物源抗体(例如，鼠源抗体)、嵌合抗体(例如，人-鼠嵌合抗体)或人源化抗体。抗体或抗原结合片段可以分离自活体或为非天然存在的。抗体或抗原结合片段可以被重组产生或被合成产生。抗体或抗原结合片段可以分离自活体或为非天然存在的。抗体或抗原结合片段可以被合成产生或被重组产生。

16、在另一个实施方案中，抗体可以来源于(分离自)任何动物，包括人、鸟等哺乳动物。例如，抗体可以是人、小鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。在本文中，人源抗体是具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白库中分离的抗体，或从转染了至少一种人免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白的动物中分离的抗体。

17、抗muc1抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，例如，可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以根据本领域众所周知的方法制备。例如，可以使用噬菌体展示法来制备。或者，抗muc1抗体可以制备为鼠源单克隆抗体。

18、在抗muc1抗体或其抗原结合片段中，除重链cdr和轻链cdr区，或重链可变区和轻链可变区之外的其它位点可以来源于免疫球蛋白的所有亚型(例如，iga、igd、ige、igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm等)，例如，它们可以来源于免疫球蛋白所有亚型的框架位点和/或轻链可变区和/或重链可变区。

19、完全抗体(例如，igg型)具有2条全长轻链和2条全长重链的结构，并且每条轻链通过二硫键与重链相连。抗体的可变区分为重链可变区和轻链可变区，重链可变区有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε)型，并有gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)和alpha2(α2)作为亚型。轻链可变区有kappa(κ)和lambda(λ)型。

20、术语“重链”被解释为包括所有全长重链的含义，所述所有全长重链包含可变区结构域vh和3个恒定区结构域ch1、ch2和ch3和铰链及其片段，所述可变区结构域vh包含具有足以给予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。此外，术语“轻链”被解释为包括全长轻链的含义，所述全长轻链包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl及其片段，所述可变区结构域vl包含具有足以给予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。

21、术语“cdr(互补决定区)”指免疫球蛋白重链和轻链的高变区的氨基酸序列。重链和轻链可以分别包含3个cdr(cdrh1、cdrh2、cdrh3和cdrl1、cdrl2、cdrl3)。cdr可以为抗体与抗原或表位的结合提供主要的接触残基。另一方面，在本说明书中，术语“特异性结合”或“特异性识别”与本领域众所周知的含义相同，是指抗原和抗体特异性相互作用以进行免疫反应。

22、术语“铰链区”是包含在抗体重链中的区域，存在于ch1和ch2区域之间，是指在抗体中为抗原结合位点提供柔性的区域。

23、当动物源抗体经历嵌合化过程时，动物源igg1铰链被人igg1铰链取代，但是动物源igg1铰链具有比人igg1铰链更短的长度，并且其两条重链之间的二硫键从3个减少至2个，因此，示出了彼此不同的铰链刚性效果。因此，铰链区的修饰可以增加人源化抗体的抗原结合效率。用于删除、添加或取代氨基酸以修饰铰链区氨基酸序列的方法是本领域众所周知的。

24、“抗原结合片段”是免疫球蛋白完整结构的片段，是指包含抗原可结合部分的多肽的一部分。例如，它可以是scfv、(scfv)2、scfvfc、fab、fab’或f(ab’)2，但不限于此。在本发明中，抗体的抗原结合片段可以是包含至少一个互补决定区的抗原片段，例如，它可以选自scfv、(scfv)2、scfv-fc、fab、fab’和f(ab’)2。抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，并且f(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，并且可以通过基因重组技术制造。

25、抗原结合片段的fab具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(ch1)的结构，并且具有一个抗原结合位点。

26、fab’不同于fab，因为它具有包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区，该半胱氨酸残基位于重链ch1结构域的c端。f(ab’)2抗体是由于半胱氨酸残基在铰链区形成二硫键而产生的。

27、fv是只有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，产生fv片段的重组技术是本领域众所周知的。在双链fv中，重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，而在单链fv(scfv)中，通常通过肽接头，重链可变区和单链可变区通过共价键连接或直接在c端连接，因此，其可以形成与双链fv相同的二聚体结构。肽接头可以与上文所述相同，例如，其长度可以为1个至100个氨基酸，例如，长度为2个至50个氨基酸，或长度为5个至25个氨基酸，并且对其中包含的氨基酸的类型没有限制。

28、抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，f(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，并且可以通过基因重组技术制造。

29、在抗原结合片段例如scfv中，重链可变区和轻链可变区可以通过或不通过接头例如肽接头连接。肽接头可以是由1个至100个或2个至50个氨基酸组成的多肽，并且对其中包含的氨基酸类型没有限制。肽接头可包含例如gly、asn和/或ser残基，也可包含中性氨基酸如thr和/或ala。只要不影响双特异性抗体的功能，接头的长度可以不同地确定。例如，肽接头可包含总共1个至100个、2个至50个或5个至25个选自gly、asn、ser、thr和ala的至少一种氨基酸。在一个实施方案中，肽接头可以表示为(g4s)n(n是(g4s)的重复数，1至10的整数，例如2至5的整数)。

30、术语“拮抗剂”被解释为包括部分或完全阻断、抑制或中和靶点(例如muc1)的至少一种生物活性的所有分子的概念。例如，“拮抗剂”抗体是指抑制或降低抗体结合的抗原的生物活性的抗体(例如，muc1)。该拮抗剂可通过与配体(靶点)的受体结合来降低受体磷酸化，或使配体激活的细胞丧失能力或死亡。此外，拮抗剂可完全破坏受体-配体相互作用，与配体竞争性结合受体，或通过改变或下调受体的三级结构而显著降低受体-配体相互作用。

31、抗muc1抗体或其抗原结合片段

32、本发明的一个实施方案提供了能够特异性识别和/或特异性结合muc1(黏蛋白-1)的多肽。

33、muc1可以是人muc1，或猴、狗、大鼠或小鼠等的muc1。在一个实施方案中，人muc1可以是muc1同种型m2(标识符：a6zid5；ncbi参考号：abs01294.1)、muc1同种型1(标识符：p15941-1)、muc1同种型2(标识符：p15941-2)、muc1同种型3(标识符：p15941-3)、muc1同种型4(标识符：p15941-4)、muc1同种型5(标识符：p15941-5)、muc1同种型6(标识符：p15941-6)、muc1同种型y(标识符：p15941-7)、muc1同种型8(标识符：p15941-8)、muc1同种型9(标识符：p15941-9)、muc1同种型f(标识符：p15941-10)、muc1同种型y-lsp(标识符：p15941-11)、muc1同种型s2(标识符：p15941-12)、muc1同种型m6(标识符：p15941-13)、muc1同种型zd(标识符：p15941-14)、muc1同种型t10(标识符：p15941-15)、muc1同种型e2(标识符：p15941-16)或muc1同种型j13(标识符：p15941-17)等，但不限于此。

34、在一个实施方案中，人muc1可具有以下ncbi参考序列中提供的氨基酸序列：np_001018016.1、np_001018017.1、np_001037855.1、np_001037856.1、np_001037857.1、np_001037858.1、np_001191214.1，np_001191215.1，np_001191216.1、np_001191217.1、np_001191218.1、np_001191219.1、np_001191220.1、np_001191221.1、np_001191222.1、np_001191223.1、np_001191224.1、np_001191225.1、np_001191226.1、np_002447.4等，但不限于此，并且每个氨基酸序列可以由以下ncbi参考序列中提供的核苷酸序列(mrna)编码：nm_001018016.2、nm_001018017.2、nm_001044390.2、nm_001044391.2、nm_001044392.2、nm_001044393.2、nm_001204285.1、nm_001204286.1、nm_001204287.1、nm_001204288.1、nm_001204289.1、nm_001204290.1、nm_001204291.1、nm_001204292.1、nm_001204293.1、nm_001204294.1、nm_001204295.1、nm_001204296.1、nm_001204297.1、nm_002456.5等，但不限于此。

35、在本说明书中，蛋白质、多肽或多核苷酸具有氨基酸序列或核苷酸序列可用于表示蛋白质、多肽或多核苷酸包含该序列，或基本上由该序列组成、或由该序列组成的所有情况。

36、这些多肽可用作抗muc1抗体的互补决定区(cdr)。然后，互补性决定区可以通过所有常用方法来确定，例如，它们可以通过imgt定义(http：//www.imgt.org/imgt_vquest/share/textes/)或kabat定义(http：//www.bioinf.org.uk/abs/)来确定，但不限于此。

37、在其它实施方案中，提供了muc1靶向多肽分子，其包含至少一种选自以下组的多肽。

38、muc1靶向多肽分子，其可包含前述抗muc1抗体的重链互补决定区和轻链互补决定区，或其组合；或包含重链互补决定区的重链可变区，包含轻链互补决定区的轻链可变区，或其组合。

39、muc1靶向多肽分子，不限于此，但可作为抗muc1抗体、抗体的抗原结合片段或抗muc1抗体的类似物(具有与抗体相似的骨架和功能的结构；例如肽体、纳米抗体等)，或前体或组成部分(例如cdr)，如多重结合抗体等。

40、术语“肽体(肽+抗体)”是其中肽和抗体的全部或部分恒定区如fc区等的融合蛋白，是指具有与抗体相似的骨架和功能的蛋白质。在本文中，上述至少一种肽可以充当抗原结合位点(重链和/或轻链cdr或可变区)。

41、术语“纳米抗体”也称为单结构域抗体，是指包含单体形式的抗体的单个可变结构域的抗体片段，并且具有与完整结构中的抗体相似的选择性结合特定抗原的特性。纳米抗体的分子量通常为约12kda至约15kda，与完全抗体(包含两条重链和两条轻链)的一般分子量(约150kda至约160kda)相比非常小，在某些情况下，其小于fab片段或scfv片段。

42、具体地，本发明提供了能够特异性识别和/或特异性结合muc1的多肽。多肽可以包含至少一个选自seq id no：1、seq id no：7、seq id no：16、seq id no：19、seq id no：27和seq id no：33的氨基酸序列，更详细地，其可以具有至少一个选自seq id no：2至seq idno：6、seq id no：8至seq id no：15、seq id no：17至seq id no：18、seq id no：20至seqid no：26、seq id no：28至seq id no：32以及seq id no：34和seq id no：38的氨基酸序列。

43、多肽及其适用的互补决定区总结在下表1中。在下表1中，vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3指重链互补决定区，vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3指轻链互补决定区。

44、[表1]

45、

46、

47、

48、在一个实施方案中，提供了抗muc1抗体或其抗原结合片段，其包含至少一种选自作为互补决定区的多肽。

49、抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含选自以下的至少一种

50、具有seq id no：1的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，

51、具有seq id no：7的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，和

52、具有seq id no：16的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，

53、作为重链互补决定区。

54、seq id no：1的氨基酸序列与下面通式1的氨基酸序列相同：

55、[通式1](seq id no：1)

56、

57、x1是d或s，

58、x2是n、s或h。

59、在一个实施方案中，可用作抗muc1抗体或其抗原结合片段的轻链cdr1的seq idno：1的多肽可具有至少一个选自例如seq id no：2至seq id no：6的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。

60、seq id no：7的氨基酸序列与下面通式2的氨基酸序列相同：

61、[通式2](seq id no：7)

62、

63、x是q、f或v，

64、x4是r或k，

65、x5是n、s、q或y，

66、x6是p或a，

67、x7是n或g，

68、x8是y、g或s，

69、x9是e或t，

70、x10是t或k，

71、x11是y或e，

72、x12是s、a或v，

73、x13是n、q或a。

74、在一个实施方案中，可用作抗muc1抗体或其抗原结合片段的重链cdr2的seq idno：7的多肽可具有至少一个选自例如seq id no：8至seq id no：15的氨基酸序列，详细的序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。

75、seq id no：16的氨基酸序列与下面通式3的氨基酸序列相同：

76、[通式3](seq id no：16)

77、

78、x14是m或f。

79、在一个实施方案中，可用作抗muc1抗体或其抗原结合片段的重链cdr3的seq idno：16的多肽可具有至少一个选自例如seq id no：17至seq id no：18的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。

80、抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含至少一种选自以下的

81、具有seq id no：19的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，

82、具有seq id no：27的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和

83、具有seq id no：33的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)，

84、作为轻链互补决定区。

85、seq id no：19的氨基酸序列与下面通式4的氨基酸序列相同：

86、[通式4](seq id no：19)

87、

88、x15是k或r，

89、x16是s或a，

90、x17是l或v，

91、x18是l、y或h，

92、x19是n或s，

93、x20是q或g，

94、x21是k或y。

95、在一个实施方案中，可用作抗muc1抗体或其抗原结合片段的轻链cdr1的seq idno：19的多肽可具有至少一个选自例如seq id no：20至seq id no：26的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。

96、seq id no：27的氨基酸序列与下面通式5的氨基酸序列相同：

97、[通式5](seq id no：27)

98、

99、x22是a或g，

100、x23是t或s，

101、x24是e或a，

102、x25是s或t。

103、在一个实施方案中，可用作抗muc1抗体或其抗原结合片段的轻链cdr2的seq idno：27的多肽可具有至少一个选自例如seq id no：28至seq id no：32的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。

104、seq id no：33的氨基酸序列与下面通式6的氨基酸序列相同：

105、[通式6](seq id no：33)

106、

107、x26是c或s，

108、x27是s或q，

109、x28是y、t或s，

110、x29是l或y。

111、在一个实施方案中，可用作抗muc1抗体或其抗原结合片段的轻链cdr3的seq idno：27的多肽可具有至少一个选自例如seq id no：34至seq id no：38的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。

112、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

113、至少一个重链互补决定区，其选自具有seq id no：1的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)、具有seq id no：7的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)和具有seq id no：16的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；

114、至少一个轻链互补决定区，其选自具有seq id no：19的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)、具有seq id no：27的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)和具有seq id no：33的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；

115、重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或

116、重链可变区和轻链可变区的组合。

117、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

118、至少一个重链互补决定区，其选自具有seq id no：2至seq id no：6的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)、具有seq id no：8至seq id no：16的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)和具有seq id no：17至seq id no：18的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；

119、至少一个轻链互补决定区，其选自具有seq id no：20至seq id no：26的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)、具有seq id no：28至seq id no：32的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)和具有seq id no：34至seq id no：38的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；

120、重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或

121、重链可变区和轻链可变区的组合。

122、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

123、重链可变区，其包含具有seq id no：2至seq id no：6的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，具有seq id no：8至seq id no：16的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，和具有seq idno：17至seq id no：18的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)；和

124、轻链可变区，其包含具有seq id no：20至seq id no：26的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，具有seq id no：28至seq id no：32的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和具有seq idno：34至seq id no：38的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)。

125、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含下表2和表3中组合的重链可变区cdr序列和轻链可变区cdr序列。

126、[表2]

127、

128、[表3]

129、

130、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

131、至少一个重链互补决定区，其选自具有seq id no：2或seq id no：4的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)、具有seq id no：8、seq id no：9或seq id no：14的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)和具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；

132、至少一个轻链互补决定区，其选自具有seq id no：21、seq id no：22、seq id no：23或seq id no：24的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)、具有seq id no：28、seq id no：29或seq id no：31的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)和具有seq id no：34、seq id no：35或seqid no：36的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；

133、重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或

134、重链可变区和轻链可变区的组合。

135、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

136、至少一个重链互补决定区，其选自具有seq id no：2的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)、具有seq id no：8或seq id no：9的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)和具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；

137、至少一个轻链互补决定区，其选自具有seq id no：21、seq id no：23或seq idno：24的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)、具有seq id no：28或seq id no：29的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)和具有seq id no：34或seq id no：35的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；

138、重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或

139、重链可变区和轻链可变区的组合。

140、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

141、1)具有seq id no：2的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，具有seq id no：9的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，具有seq idno：21的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，具有seq id no：28的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和具有seq id no：35的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)；

142、2)具有seq id no：2的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，具有seq id no：9的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，具有seq idno：23的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，具有seq id no：28的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和具有seq id no：36的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)；

143、3)具有seq id no：2的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，具有seq id no：9的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，具有seq idno：24的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，具有seq id no：29的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和具有seq id no：35的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)；

144、4)具有seq id no：2的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，具有seq id no：8的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，具有seq idno：23的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，具有seq id no：28的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和具有seq id no：34的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)；或

145、5)具有seq id no：2的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，具有seq id no：8的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，具有seq id no：17的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，具有seq idno：24的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，具有seq id no：29的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和具有seq id no：35的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)。

146、抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含至少一个重链可变区的框架序列、至少一个轻链可变区的框架序列、或至少一个重链可变区的框架序列和至少一个轻链可变区的框架序列。重链可变区的框架序列和轻链可变区的框架序列的一个实例示出在下表4至表7中。

147、[表4]

148、

149、[表5]

150、

151、[表6]

152、

153、[表7]

154、

155、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可以是包含重链互补决定区(上表2中的vh0至vh9)的重链可变区、包含轻链互补决定区(上表3中的vl0至vl9)的轻链可变区，或其组合。例如，重链可变区可包含选自seq id no：77至seq id no：86的氨基酸序列，轻链可变区可包含选自seq id no：87至seq id no：96的氨基酸序列。例如，重链可变区可包含选自seq id no：77至seq id no：86的氨基酸序列，轻链可变区可包含选自seq idno：87至seq id no：96的氨基酸序列。

156、因此，抗muc1抗体或其抗原结合片段可以包含

157、具有选自seq id no：77至seq id no：86的氨基酸序列的重链可变区；

158、具有选自seq id no：87至seq id no：96的氨基酸序列的轻链可变区；或

159、其组合。

160、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可以包含

161、具有seq id no：78、seq id no：81、seq id no：84或seq id no：85的氨基酸序列的重链可变区；和

162、具有seq id no：89、seq id no：90、seq id no：91、seq id no：92、seq id no：94或seq id no：95的氨基酸序列的轻链可变区。

163、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

164、具有seq id no：78、seq id no：81或seq id no：84的氨基酸序列的重链可变区；和

165、具有seq id no：89、seq id no：91或seq id no：92的氨基酸序列的轻链可变区。

166、在一个实施方案中，抗muc1抗体或其抗原结合片段可包含

167、1)具有seq id no：78的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no：89的氨基酸序列的轻链可变区；

168、2)具有seq id no：78的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no：91的氨基酸序列的轻链可变区；

169、3)具有seq id no：78的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no：92的氨基酸序列的轻链可变区；

170、4)具有seq id no：81的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no：91的氨基酸序列的轻链可变区；

171、5)具有seq id no：81的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no：92的氨基酸序列的轻链可变区；或

172、6)具有seq id no：84的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no：91的氨基酸序列的轻链可变区。

173、术语“表位”被解释为抗原决定簇，即被抗体识别的抗原的一部分。在一个具体实施方案中，表位可以是包含muc1蛋白内的区域的多肽，例如seq id no：109的氨基酸序列。

174、因此，抗muc1抗体或抗原结合片段可特异性结合包含seq id no：109的氨基酸序列的表位。

175、多重结合抗体

176、本发明的一个实施方案涉及包含可特异性识别和/或特异性结合muc1的多肽的多重结合抗体或多特异性抗体，更具体地，其可以是包含可特异性识别和/或特异性结合第二靶点的多肽以及可特异性识别和/或特异性结合muc1的多肽的双特异性抗体。

177、在本说明书中，术语“多重结合抗体”是指识别和/或结合2种或多于2种不同抗原，或识别和/或结合相同抗原的彼此不同的位点的抗体，并且多重结合抗体的一个抗原结合位点可以包含上述多肽。

178、本发明的另一个实施方案涉及双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合muc1的第一抗原结合结构域和特异性结合cd3的第二抗原结合结构域。具体地，本发明的一个实施方案涉及双特异性抗体，其包含至少一个对根据本发明的muc1抗体或其抗原结合片段特异的抗原结合位点和t细胞活化抗原。

179、在双特异性抗体中，t细胞活化抗原可以是cd3 t细胞协同受体(cd3；分化簇3)抗原(例如，抗cd3 epsilon(ε)抗原)，并且双特异性抗体可以包括抗cd3抗体，其包含针对cd3抗原或其抗原结合片段的抗原结合位点。

180、具体地，其涉及包含抗muc1抗体或其抗原结合片段以及抗cd3抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体(换句话说，抗muc1/抗cd3双特异性抗体)。抗muc1/抗cd3双特异性抗体可表现出协同效应，同时保持对muc1和cd3每种抗原的亲和力和活性。

181、双特异性抗体特异性结合第一抗原muc1，并可包含抗muc1抗体或其抗原结合片段。抗muc1抗体或其抗原结合片段可以与上述相同。

182、此外，双特异性抗体特异性结合第二抗原cd3，并且具体地，其可以包含抗cd3抗体或其抗原结合片段。抗cd3抗体或抗原结合片段可以是与人、猴、小鼠等的cd3结合的抗体或其抗原结合片段。抗cd3抗体或其抗原结合片段可用于靶向表达cd3的t细胞，或刺激t细胞活化。本发明的抗cd3抗体或其抗原结合片段可以作为双特异性抗体的一部分，该双特异性抗体引导针对特定细胞类型的cd3介导的t细胞活化，例如肿瘤细胞或传染性病原体。

183、可以无限制地使用抗cd3抗体或其抗原结合片段，只要其为特异性结合cd3的抗体，例如okt3抗体或其抗原结合片段、ucht-1抗体或其抗原结合片段、sp34抗体或其抗原结合片段等，但不限于此。okt3抗体可以是小鼠或人源化免疫球蛋白igg2a同种型单克隆抗体。已知ucht-1抗体与人t细胞受体(tcr)/cd3复合物的约20kda cd3ε小单元反应，已知sp34抗体与cd3ε小单元结合。用于获得okt3抗体、ucht-1抗体或sp34抗体的方法是本领域众所周知的。

184、在一个具体实施方案中，抗cd3抗体或其抗原结合片段可包含至少一个cdr序列，优选6个cdr序列，选自下列多肽(参见下表8)：

185、具有seq id no：97的氨基酸序列的多肽(vh-cdr1)，

186、具有seq id no：98的氨基酸序列的多肽(vh-cdr2)，

187、具有seq id no：99的氨基酸序列的多肽(vh-cdr3)，

188、具有seq id no：100的氨基酸序列的多肽(vl-cdr1)，

189、具有seq id no：101的氨基酸序列的多肽(vl-cdr2)，和

190、具有seq id no：102的氨基酸序列的多肽(vl-cdr3)。

191、更具体地，抗cd3抗体或其抗原结合片段

192、可包含具有seq id no：103氨基酸序列的重链可变区，和具有seq id no：104或seq id no：105氨基酸序列的轻链可变区。

193、[表8]

194、

195、抗cd3抗体的抗原结合片段可以选自抗cd3抗体的scfv、(scfv)2、fab、fab’和f(ab’)2。

196、根据本发明的抗muc1/抗cd3双特异性抗体可以是其中抗cd3抗体或其抗原结合片段连接到抗muc1抗体或其抗原结合片段的c端或n端的抗体。

197、例如，它可以是与抗muc1抗体或其抗原结合片段的重链n端或c端结合的抗cd3抗体scfv(抗muc1重链n端-抗cd3 scfv或抗muc1重链c端-抗cd3 scfv)，或与抗muc1轻链n端或c端结合的抗cd3抗体scfv(抗muc1轻链n端-抗cd3 scfv或抗muc1轻链c端-抗cd3 scfv)。此外，它可以是双特异性抗体，形式为具有一个抗muc1抗体的抗原结合位点和一个抗cd3抗体的抗原结合位点(1+1)、可以在一个双特异性抗体的3个抗原结合位点中各有两个和一个(1+2或2+1)或在4个抗原结合位点中各有2个(2+2)，包括其中抗cd3 scfv以单价或二价形式结合的双特异性抗体，但不限于此。

198、在一个实施方案中，抗muc1/抗cd3双特异性抗体可包含抗muc1抗体或其抗原结合片段，以及连接到重链或轻链的c端或n端的抗cd3抗体或其抗原结合片段，例如，抗muc1抗体或其抗原结合片段的轻链的n端。在一个实施方案中，抗muc1/抗cd3双特异性抗体可包含抗muc1的完全抗体(例如，igg型抗体)和抗cd3抗体的抗原结合片段(例如，scfv、(scfv)2、scfv-fc、fab、fab’和f(ab’)2)，其连接到抗体轻链的n端。

199、在抗muc1/抗cd3双特异性抗体中，抗muc1抗体或其抗原结合片段和抗cd3抗体或其抗原结合片段可以通过或不通过接头连接，例如肽接头。此外，抗原结合片段中的重链部分和轻链部分，例如scfv片段中的重链可变区和轻链可变区也可以通过或不通过肽接头连接。连接抗muc1抗体或抗原结合片段和抗cd3抗体或其抗原结合片段的肽接头，以及连接抗原结合片段中重链部分和轻链部分的肽接头可以相同或不同。肽接头可以是由1个至100个或2个至50个氨基酸组成的多肽，并且其中所包含的氨基酸类型没有限制。肽接头可包含例如gly、asn和/或ser残基，也可包含中性氨基酸如thr和/或ala。适用于肽接头的氨基酸序列是本领域已知的。另一方面，接头的长度可以不同地确定，只要不影响双特异性抗体的功能。例如，肽接头可以由总共1个至100个、2个至50个或5个至25个选自gly、asn、ser、thr和ala的至少一种氨基酸序列组成。在一个实施方案中，肽接头可以表示为(g4s)n(n是(g4s)的重复数，1至10的整数，例如2至5的整数)。

200、在一个实施方案中，抗muc1/抗cd3双特异性抗体可以是抗cd3抗体的scfv形式，其与位于抗muc1抗体或其抗原结合片段中的轻链n端结合。与其中抗cd3抗体scfv结合到位于抗muc1抗体或其抗原结合片段中的轻链的c端的抗muc1/抗cd3双特异性抗体相比，其中抗cd3抗体scfv结合到位于抗muc1抗体或其抗原结合片段中的轻链的n端的抗muc1/抗cd3双特异性抗体可具有更优异的抗癌细胞的细胞毒性、癌细胞增殖抑制效果和/或癌症治疗效果。

201、医疗用途

202、其他方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含抗muc1抗体或抗原结合片段，或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或抗原结合片段。

203、其他方面提供了预防或治疗癌症的方法，包括向需要预防或治疗癌症的对象施用药学有效剂量的抗muc1抗体或抗原结合片段，或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或抗原结合片段。用于预防和/或治疗癌症的方法还可以包括在施用前确认患者需要预防和/或治疗癌症。

204、抗muc1抗体或抗原结合片段，或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或抗原结合片段可有效用于预防或治疗癌症。本说明书中提供的抗muc1抗体或抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或抗原结合片段表现出作为muc1激动剂的功能，因此，为了使抗muc1抗体或抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或抗原结合片段表现出功效(例如，抗癌功效，如癌细胞死亡等)，对于所应用的癌症，表达muc1的相应癌细胞可能是有利的，例如，它可以是表达muc1的实体癌。具体而言，本发明的一个实施方案涉及特异性结合muc-1的新型抗体及其用途，所述抗体具有改善的实体癌靶点向性和治疗性。在一个实施方案中，癌症可以包含至少一种选自血癌(例如，b细胞淋巴瘤等)、骨髓炎、甲状腺癌、子宫癌(例如宫颈癌)、皮肤癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌，或其中抗muc1抗体或抗原结合片段特异性结合的抗原的表位表达至30％或高于30％的实体癌，但不限于此。

205、在药物组合物或方法中，药物有效剂量的抗muc1抗体或其抗原结合片段或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段可与至少一种添加剂一起提供，所述添加剂选自药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂等。

206、药学上可接受的载体通常用于制备抗体，并且可以是选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、褐藻胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等的至少一种，但不限于此。除了上述组分之外，药物组合物还可以包含选自稀释剂、赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等的至少一种，其通常用于制备药物组合物。

207、药物组合物、抗muc1抗体或其抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或抗原结合片段可以口服或非肠道施用。在非肠道施用的情况下，可以通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮内施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠内施用等方式施用。在口服施用的情况下，蛋白质或肽被消化，因此应当配制口服组合物以包裹活性药物或保护其在胃中不降解。此外，该组合物可以用任何装置施用，在该装置中活性物质可以移动到靶细胞。

208、药物组合物、抗muc1抗体或抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段的适当剂量可由诸如制备方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病状况、食物、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性等因素来不同地规定。例如，药物组合物、抗muc1抗体或抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段的每日剂量可为0.001mg/kg至1000mg/kg，具体地，0.01mg/kg至100mg/kg，更具体地，0.1mg/kg至50mg/kg，但不限于此。每日剂量可以被配制成一种单位剂型的制剂，或通过适当分配来配制，或通过将其插入多剂量容器中来制备。术语“药物有效剂量”是指能够显示活性成分(即，抗muc1抗体或抗原结合片段，或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段)的期望效果，换句话说，预防和/或治疗癌症的效果的量，并且其可以由诸如制备方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病状况、食物、施用时间、施用途径、排泄速率和反应活性的因素来不同地规定。

209、该药物组合物可以以单剂量形式制备，或通过将其插入多剂量容器中，通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂将其配制而制备。此时，制剂可以是在油或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液形式，或可以是提取物、粉末、粉状剂、颗粒、片剂或胶囊形式，并且可以额外包含分散剂或稳定剂。

210、此外，药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或与另一种治疗剂联合施用，并且可以与常规治疗剂先后或同时施用。

211、另一方面，药物组合物包括抗体或其抗原结合片段，因此它可以被配制成免疫脂质体。包含抗体的脂质体可以根据本领域众所周知的方法制备。免疫脂质体是包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，，可通过逆相蒸发法制备。例如，抗体fab’片段可以通过二硫键置换反应与脂质体结合。脂质体中还可以包含化学治疗剂，例如阿霉素。

212、所述药物组合物的施用对象或接受所述预防和/或治疗方法施用的患者可以是哺乳动物，例如灵长类动物如人、猴等，或啮齿类动物如大鼠、小鼠等，但不限于此，并且可以是对常规抗癌剂的拮抗剂，例如靶细胞膜蛋白(例如muc1)，具有抗性的癌症患者。

213、多肽、重组载体和抗体的制备方法

214、本发明的其他实施方案提供了编码上述多肽的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，多核苷酸可以编码包含至少一个选自seq id no：2至seq id no：6、seq id no：8至seqid no：15、seq id no：17至seq id no：18、seq id no：20至seq id no：26、seq id no：28至seq id no：32和seq id no：34和seq id no：38的氨基酸序列的多肽。

215、在其他具体实施方案中，多核苷酸可以编码包含选自seq id no：77至seq id no：96的氨基酸序列的多肽。

216、其他实施方案提供了包含多核苷酸的重组载体。

217、其他实施方案提供了用重组载体转化的重组细胞。

218、术语“载体”是指在宿主细胞中表达目的基因的手段。例如，它包括病毒载体如质粒载体、黏粒载体和噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。可用作重组载体的载体可以是本领域常用的通过工程所构建的质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列和puc19等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-卡隆、λδz1和m13等)或病毒(例如，sv40等)，但不限于此。

219、在重组载体中，多核苷酸可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”指核苷酸表达调控序列(例如启动子序列)和另一个核苷酸序列之间的功能性结合。调节序列可以通过“可操作地连接”来调节另一个核苷酸序列的转录和/或翻译。

220、重组载体通常可以构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。用于表达的载体可以使用一种用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的常用载体。重组载体可以通过本领域已知的各种方法构建。

221、重组载体可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。例如，当使用的载体是表达载体，并使用原核细胞作为宿主时，通常包含能够进行转录的强启动子(例如，plλ启动子、cmv启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)，起始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。当使用真核细胞作为宿主时，包含在载体中的在真核细胞中起作用的复制起点包括f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺复制起点、aav复制起点和bbv复制起点等，但不限于此。此外，可以使用来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子和hsv的tk启动子)作为转录终止序列，其通常具有多聚腺苷酸化序列。

222、重组细胞可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞中来获得。作为宿主细胞，可以使用本领域已知的能够稳定和持续克隆或表达重组载体的任何宿主细胞，并且原核细胞包括例如大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x 1776、大肠杆菌w3110、芽孢杆菌菌株如枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌、以及肠杆菌菌株如鼠伤寒沙门菌、黏质沙雷菌和各种假单胞菌等，并且当其转化到真核细胞中时，作为宿主细胞，可以使用酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如sp2/0、cho(中国仓鼠卵巢)k1、cho dg44、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck细胞系等，但不限于此。

223、将多核苷酸或包含其的重组载体递送(引入)到宿主细胞中，可以使用本领域众所周知的递送方法。作为递送方法，例如，当宿主细胞是原核细胞时，可以使用cacl2方法或电穿孔方法等，当宿主细胞是真核细胞时，可以使用显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染和基因枪法等，但不限于此。

224、用于筛选转化的宿主细胞的方法可以根据本领域众所周知的方法，使用由选择标记表达的表型容易地进行。例如，当选择标记是特定的抗生素抗性基因时，通过在含有抗生素的培养基中培养转化体，可以容易地筛选转化体。

225、其它实施方案提供了用于制备多肽或抗muc1抗体或抗原结合片段，或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在重组细胞中表达多核苷酸。表达多核苷酸可包括在允许本文所含多核苷酸表达的条件下培养重组细胞。制备多肽或抗muc1抗体或抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法还可包括在表达或培养后分离和/或纯化多肽或抗muc1抗体或抗原结合片段、或抗muc1/抗cd3双特异性抗体或其抗原结合片段。

226、有益效果

227、抗muc1抗体和抗muc1/抗cd3双特异性抗体可有效抑制癌细胞的生长，因此，它们对预防或治疗癌症具有优异的效果。

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技术实现思路