乙型肝炎病毒(HBV)表达的调节的制作方法

背景技术：

1、乙型肝炎是一种通过受污染的材料(如血液和血液产品)、受污染的针头肠胃外传播、性传播和从受感染的或携带者母体向其后代进行垂直传播的病毒性疾病。据世界卫生组织估计，全球有超过20亿人感染，其中每年约有400万例急性病例、每年100万例死亡和3.5-4亿例慢性携带者(世界卫生组织：乙型肝炎患病率的地理患病率,2004.

2、http://www.who.int/vaccines-surveillance/graphics/htmls/hepbprev.htm)。

3、病毒，即hbv是仅感染人和非人灵长类动物的双链嗜肝病毒。病毒复制主要发生在肝脏中，并且在较小程度上发生在肾脏、胰腺、骨髓和脾脏中(乙型肝炎病毒生物学(hepatitis b virus biology).《微生物学和分子生物学评论(microbiol mol biolrev.)》64:2000；51-68.)。病毒和免疫标志物在血液中是可检测的，并且特征性抗原-抗体模式随时间推移而演变。第一种可检测的病毒标志物是hbsag，随后是乙型肝炎e抗原(hbeag)和hbv dna。在温育期间，滴度可能很高，但hbv dna和hbeag水平在疾病发作时开始下降，并且在峰值临床疾病时可能无法检测到(乙型肝炎病毒感染—自然史和临床后果(hepatitis b virus infection—natural history and clinical consequences).《新英格兰医学杂志(n engl j med.)》,350:2004；1118-1129)。hbeag是血液中可检测的病毒标志物，并且与活性病毒复制相关，并且因此与高病毒负载和感染性相关(乙型肝炎e抗原—乙型肝炎的危险结束游戏(hepatitis b e antigen—the dangerous end game ofhepatitis b).《新英格兰医学杂志》347:2002；208-210)。抗hbsab和抗hbcab(igg)的存在指示先前感染的个体的恢复和免疫。

4、当前，美国肝脏疾病研究协会(american association for the study of liverdiseases，aasld)和欧洲肝脏研究协会(european association for the study of theliver，easl)推荐的用于慢性hbv感染的疗法包含干扰素α(infa)、peg化干扰素α-2a(peg-ifn2a)、恩替卡韦(entecavir)和替诺福韦(tenofovir)。核苷和核苷酸疗法，恩替卡韦和替诺福韦在减少病毒负载方面是成功的，但hbeag血清转化和hbsag损失的速率甚至低于使用ifna疗法获得的hbeag血清转化和hbsag损失的速率。还使用了其它类似疗法，包含拉米夫定(lamivudine)(3tc)、替比夫定(telbivudine)(ldt)和阿德福韦(adefovir)，但通常对于核苷/核苷酸疗法，抗性的出现限制了治疗功效。

5、因此，本领域需要发现和开发新的抗病毒疗法。另外地，需要能够增加hbeag和hbsag血清转化速率的新的抗hbv疗法。最近的临床研究已发现血清转化与hbeag的降低(fried等人(2008)《肝病学(hepatology)》47:428)和hbsag的降低(moucari等人(2009)《肝病学》49:1151)之间存在相关性。抗原水平的降低可能已经允许对hbv感染进行免疫控制，因为高水平的抗原被认为诱导免疫耐受性。当前针对hbv的核苷疗法能够显著降低hbv的血清水平，但对hbeag和hbsag水平几乎没有影响。

6、反义技术正在成为用于减少特异性基因产物的表达的有效手段，并且因此可以证明在许多治疗、诊断中是唯一有用的。反义疗法与核苷疗法的不同之处在于，所述反义疗法可以直接靶向用于hbv抗原的转录物，并且由此降低血清hbeag和hbsag水平。由于在hbv感染时产生的多种重叠转录物，因此单一反义低聚物也有机会减少除了hbeag和hbsag两者之外的hbv dna。因此，反义技术正在成为用于减少某些基因产物的表达的有效手段，并且因此可以证明在用于调节hbv的许多治疗、诊断和研究应用中是唯一有用的。

7、已经开发了具有直接侧接在5'翼区段与3'翼区段之间的单个间隙区段的hbv反义寡核苷酸(wo 2012/145697)。然而，具有此结构的hbv反义寡核苷酸中的许多hbv反义寡核苷酸在降低血清hbsag水平和/或引起慢性乙型肝炎患者中的安全性问题方面表现出最小功效。因此，本领域需要改进的hbv反义寡核苷酸。

技术实现思路

1、本公开通过使用一个或多个分隔子提供提供另外的分割的间隙结构的增强的经修饰的寡核苷酸结构来扩展hbv反义寡核苷酸的原理。

2、本公开至少部分地基于以下发现：侧接在经修饰的寡核苷酸中的5'翼区段与3'翼区段之间的不连续间隙区段提供了优于具有连续间隙的常规反义寡核苷酸的改善的活性(例如，血清hbsag水平或hbeag水平的降低)。直接置于间隙区段之间的一个或多个分隔子区段可以提供反义寡核苷酸的改善的活性，这不同于本领域的当前教导，从而表明分隔子区段可能导致不良活性。本发明人已出乎意料地发现，在全长反义寡核苷酸的特定位置处放置分隔子区段提供了改善的活性，而在其它位置中的分隔子区段则导致活性降低或活性无变化。进一步地，分隔子区段中仅特定类型的核苷修饰提供改善的活性，而分隔子区段中其它类型的核苷修饰则导致活性降低或活性无变化。不受理论束缚，核苷修饰和分隔子区段在全长反义寡核苷酸内的定位的特定组合改善了rna酶h核酸内切酶的结合和活性，而不损害与hbv靶序列的互补性。

3、本公开至少部分地基于以下发现：5'翼区段和3'翼区段的特异性核苷修饰降低了体内毒性(例如，alt水平的降低、肝脏毒性的代理或cc30(细胞毒性浓度，以将细胞活力降低30％))。本发明人已出乎意料地发现5'翼区段中的特定类型的经修饰的核苷使得体内毒性增加，而3'翼区段中的特定类型的经修饰的核苷使得体内毒性降低。进一步地，经修饰的核苷在5'翼区段和3'翼区段内的定位也有助于体内毒性。不受理论束缚，核苷修饰和定位于5'翼区段和3'翼区段内的特定组合有助于全长反义寡核苷酸与hbv靶序列的互补性。虽然位于某些位置处的特定类型的修饰的组合改善了互补性，但特定类型的修饰和位置的其它组合降低了互补性，从而使得脱靶结合增加，这最终导致毒性。

4、本文提供了用于调节hbv mrna和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。在某些实施例中，可用于调节hbv mrna和蛋白质的表达的化合物是反义化合物。在某些实施例中，反义化合物是反义寡核苷酸。

5、在某些实施例中，调节可以发生在细胞或组织中。在某些实施例中，细胞或组织是动物的细胞或组织。在某些实施例中，动物是人。在某些实施例中，hbv mrna水平降低。在某些实施例中，hbv dna水平降低。在某些实施例中，hbv蛋白水平降低。在某些实施例中，hbv抗原水平降低。在某些实施例中，hbv s抗原(hbsag)水平降低。在某些实施例中，hbv e抗原(hbeag)水平降低。此类降低可以以时间依赖性方式或剂量依赖性方式发生。

6、还提供了可用于预防、治疗和改善疾病、病症和病状的方法、化合物和组合物。在某些实施例中，此类hbv相关疾病、病症和病状是肝脏疾病。在某些实施例中，此类肝脏疾病、病症和病状包含黄疸、肝癌、肝脏炎症、肝脏纤维化、炎症、肝硬化、肝脏衰竭、弥漫性肝细胞炎性疾病、噬血细胞综合征、血清肝炎、hbv病毒血症和肝脏疾病相关移植。在某些实施例中，此类hbv相关疾病、病症和病状是过度增殖性疾病、病症和病状。在某些实施例中，此类过度增殖性疾病、病症和病状包含癌症以及相关的恶性肿瘤和转移。在某些实施例中，此类癌症包含肝癌和肝细胞癌(hcc)。

7、此类疾病、病症和病状可具有共同的一个或多个风险因素、原因或结果。肝脏疾病或过度增殖性疾病的发展的某些风险因素和原因包含以下：年龄增长；烟草使用；暴露于阳光和电离辐射；与某些化学品接触；感染某些病毒和细菌；某些激素疗法；癌症家族史；酒精使用；以及某些生活方式选择，包含不良饮食、缺乏身体活动和/或超重。与肝脏疾病或过度增殖性疾病的发展相关的某些症状和结果包含但不限于：流感样疾病、虚弱、疼痛、头痛、发热、食欲不振、腹泻、黄疸、恶心和呕吐、身体肝脏区疼痛、粘土色或灰色粪便、全身瘙痒和深色尿液。

8、在某些实施例中，治疗的方法包含向有需要的个体施用hbv反义化合物。在某些实施例中，治疗的方法包含向有需要的个体施用hbv反义寡核苷酸。