嵌合神经向性AAV衣壳

本发明涉及嵌合aav衣壳、包含所述嵌合aav衣壳的病毒载体，以及使用所述载体诸如靶向神经系统的方法。本发明进一步涉及对神经细胞(例如，中枢和/或外周神经系统的细胞)具有改善的感染性的嵌合aav衣壳、包含所述嵌合aav衣壳的病毒载体，以及使用所述载体以改善的感染性靶向神经细胞的方法。

背景技术：

1、腺相关病毒(aav)是用于治疗中枢神经系统(cns)疾病的候选物，特别是aav血清型9具有cns亲和力并有效地在cns中递送基因。然而，在人类群体中，33.5％的患者具有预先存在的针对aav9的中和抗体(抗aav9)(boutin等2010hum gene ther.21(6):704-712)，这限制了aav9疗法在临床中的应用，因为预先存在的nab可阻止aav载体转导并且通常导致所提出的基因疗法方案失败(erles等1999j med virol 59(3):406-411；li等2012genether.1993):288-94；louis jeune等2013hum gene ther methods24(2):59-67；murphy等2008mol ther 16(1):138-145)。因此，需要寻找新的aav载体以有效地感染神经元细胞。

2、本发明通过提供对神经元细胞具有改善的感染性的经修饰的嵌合aav衣壳来克服本领域中的缺点。

技术实现思路

1、本发明的一个方面包含第一血清型的嵌合腺相关病毒(aav)衣壳，其包含所述第一血清型的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白，其中：a)所述vp1衣壳蛋白和/或所述vp2衣壳蛋白包含在氨基酸位置24、41、125、129、135、147、159、162、164、168、194、196、197、198、200、201、203、205、224、233和/或235处的一个或多个取代，并且b)所述vp3衣壳蛋白包含vp3可变区(vr)中的一个或多个氨基酸取代；其中编号对应于seq id no:16，并且其中与所述第一血清型的对应野生型aav衣壳的神经向性相比，所述嵌合aav衣壳具有增强的神经向性。

2、在一些实施方案中，vp3 vr中的一个或多个氨基酸取代可在vp3 vr-i、vr-ii、vr-iii、vr-iv、vr-v、vr-vi、vr-vii、vr-viii、hi环和/或vr-ix中。

3、在一些实施方案中，嵌合aav载体可与选自由以下组成的组的化合物共价连接、结合或将其衣壳化：dna分子(例如，cas9-质粒)、rna分子(例如，crispr rna)、多肽、碳水化合物、脂质、小有机分子和它们的任何组合(例如，crispr rnp)。

4、本发明的另一方面提供了aav颗粒，其包含：本发明的嵌合aav衣壳；和aav载体基因组；其中所述aav衣壳将所述aav载体基因组衣壳化。

5、在另一方面，本发明提供了编码本发明的嵌合aav衣壳的核酸分子。

6、在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸分子的载体。

7、在另一方面，本发明提供了包含本发明的嵌合颗粒、核酸分子和/或载体的细胞(例如，体外细胞)。

8、还提供了药物制剂，其包含在药学上可接受的载剂中的本发明的aav颗粒、核酸分子和/或载体。

9、本发明的另一方面包含产生包含aav衣壳的重组aav颗粒的方法，所述方法包括：在可发生包含所述aav衣壳并将包含异源核酸分子的aav载体基因组衣壳化的所述重组aav颗粒的组装的条件下，在体外向细胞提供/引入本发明的核酸分子、aav rep编码序列、所述aav载体基因组和用于生成生产性aav感染的辅助功能物(helper function)。

10、还提供了通过本发明的方法产生的aav颗粒。

11、本发明的另一方面提供了将核酸分子递送到神经细胞(例如，包括外周和中枢神经系统的细胞，例如，脑细胞，诸如神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞，例如，脊髓，诸如颈、胸、腰、骶神经元和/或背根神经节(drg))的方法，所述方法包括使所述神经细胞与本发明的aav颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或药物配制剂接触。

12、本发明的另一方面提供了将核酸分子递送到哺乳动物受试者的神经细胞的方法，所述方法包括：施用有效量的本发明的aav颗粒、核酸分子、载体、细胞和/或药物配制剂，由此将所述核酸分子递送到所述哺乳动物受试者的神经细胞。

13、本发明的另一方面提供了治疗有需要的哺乳动物受试者的病症(例如，cns病症，例如，pns病症)的方法，其中所述病症可通过在所述受试者的神经系统中表达编码治疗性产物的核酸分子来治疗，所述方法包括在使编码所述治疗性产物的所述核酸分子在所述神经系统中表达的条件下，向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的本发明的aav颗粒、核酸、载体、细胞和/或药物配制剂，由此治疗所述病症。

1.一种第一血清型的嵌合腺相关病毒(aav)衣壳，其包含所述第一血清型的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白，其中：

2.根据权利要求1所述的嵌合aav衣壳，其中所述vp3 vr中的所述一个或多个氨基酸取代在vp3 vr-i、vr-ii、vr-iii、vr-iv、vr-v、vr-vi、vr-vii、vr-viii、hi环和/或vr-ix中。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合aav衣壳，其中所述vp3 vr中的所述一个或多个氨基酸取代在vr-i中的氨基酸位置263、264、265、267和/或268处。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合aav衣壳，其中所述vp3vr中的所述一个或多个氨基酸取代在vr-viii中的氨基酸位置584和/或598处。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合aav衣壳，其中所述vp3vr中的所述一个或多个氨基酸取代在vr-ix中的氨基酸位置714处。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合aav衣壳，其进一步包含所述vp3衣壳蛋白中在vr外部的一个或多个取代。

7.根据权利要求6所述的嵌合aav衣壳，其中所述vp3衣壳蛋白中在vr外部的所述一个或多个氨基酸取代包含在位置272、311、313、640、642、646和/或722处的氨基酸取代。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合aav衣壳，其中与对应野生型aav衣壳的神经向性相比，所述增强的神经向性增强约5.0倍或更高。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合aav衣壳，其与选自由以下组成的组的化合物共价连接、结合或将其衣壳化：dna分子(例如，cas9-质粒)、rna分子(例如，crispr rna)、多肽、碳水化合物、脂质、小有机分子和它们的任何组合(例如，crispr rnp)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合aav衣壳，其中所述第一aav血清型是aav1、aav2、aav3、aav4、aav6、aav7、aav8和/或aav9。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的嵌合aav衣壳，其中所述第一aav血清型是aav6。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的嵌合aav衣壳，其包含：

13.根据权利要求12所述的嵌合aav衣壳，

14.根据权利要求13所述的嵌合aav衣壳，

15.根据权利要求12-14中任一项所述的嵌合aav衣壳，其包含与seq id no:1(aavh43)的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。

16.根据权利要求1-11中任一项所述的嵌合aav衣壳，其包含：

17.根据权利要求16所述的嵌合aav衣壳，

18.根据权利要求17所述的嵌合aav衣壳，

19.根据权利要求16-18中任一项所述的嵌合aav衣壳，其包含与seq id no:6(aavh48)的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。

20.根据权利要求1-11中任一项所述的嵌合aav衣壳，其包含：

21.根据权利要求20所述的嵌合aav衣壳，

22.根据权利要求21所述的嵌合aav衣壳，

23.根据权利要求20-22中任一项所述的嵌合aav衣壳，其包含与seq id no:11(aavh67)的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。

24.一种aav颗粒，其包含：

25.根据权利要求24所述的aav颗粒，其中所述aav载体基因组包含异源核酸分子。

26.根据权利要求25所述的aav颗粒，其中所述异源核酸分子编码crispr rna、crisprrnp、反义rna、微rna或rnai。

27.根据权利要求25所述的aav颗粒，其中所述异源核酸分子编码多肽。

28.根据权利要求25所述的aav颗粒，其中所述异源核酸分子编码治疗性多肽。

29.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-23中任一项所述的嵌合aav衣壳。

30.一种载体，其包含根据权利要求29所述的核酸分子。

31.根据权利要求30所述的载体，其中所述载体是质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。

32.根据权利要求31所述的载体，其中所述病毒载体是aav载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、甲病毒载体或杆状病毒载体(例如，aav颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒、慢病毒颗粒、甲病毒颗粒、杆状病毒颗粒等)。

33.根据权利要求32所述的aav载体，其中所述核酸分子进一步包含aav rep编码序列。

34.一种细胞(例如，体外细胞)，其包含根据权利要求1-23中任一项所述的嵌合aav衣壳、根据权利要求24-28中任一项所述的颗粒、根据权利要求29所述的核酸分子或根据权利要求30-33中任一项所述的载体。

35.根据权利要求34所述的细胞，其中所述核酸分子稳定地掺入所述细胞的基因组中。

36.一种产生包含aav衣壳的重组aav颗粒的方法，所述方法包括：

37.一种aav颗粒，其通过根据权利要求36所述的方法产生。

38.一种药物配制剂，其包含在药学上可接受的载剂中的根据权利要求24-28或37中任一项所述的aav颗粒、根据权利要求29所述的核酸、根据权利要求30-33中任一项所述的载体和/或根据权利要求34或35所述的细胞。

39.一种将核酸分子递送到神经细胞(例如，包括外周和中枢神经系统的细胞，例如，脑细胞，诸如神经元、少突胶质细胞、神经胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞，例如，脊髓，诸如颈、胸、腰、骶神经元和/或背根神经节(drg)神经元)的方法，所述方法包括使所述神经细胞与根据权利要求24-28或37中任一项所述的aav颗粒、根据权利要求29所述的核酸、根据权利要求30-33中任一项所述的载体、根据权利要求34或35所述的细胞和/或根据权利要求38所述的药物配制剂接触。

40.一种将核酸分子递送到哺乳动物受试者的神经细胞的方法，所述方法包括：

41.一种治疗有需要的哺乳动物受试者的病症(例如，cns病症，例如，pns病症)的方法，其中通过在所述受试者的神经系统中表达编码治疗性产物的核酸分子能治疗所述病症，所述方法包括在使编码所述治疗性产物的所述核酸分子在所述神经系统中表达的条件下，向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的根据权利要求24-28或37中任一项所述的aav颗粒、根据权利要求29所述的核酸、根据权利要求30-33中任一项所述的载体、根据权利要求34或35所述的细胞和/或根据权利要求38所述的药物配制剂，由此治疗所述病症。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述病症是帕金森氏病、亨廷顿氏病、雷特综合征、肌萎缩侧索硬化(als)、多发性硬化(ms)、癫痫、阿尔茨海默氏病(gdf；脑啡肽酶)、巴滕病(蜡样质脂褐质沉积症神经元蛋白[cln]1-10)、弗里德希氏共济失调(frda、弗里共济失调蛋白基因[fxn])、脑创伤、脊髓损伤(sci)、缺血性和缺氧性cns疾病、脑和脊髓肿瘤，或它们的任何组合。

43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。

44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中将所述aav颗粒递送或施用到所述神经系统。

45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中将所述aav颗粒递送或施用到所述受试者的灰质。

46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中将所述aav颗粒递送或施用到脊髓(例如，颈、胸、腰和/或骶脊髓区域)。

47.根据权利要求40-46中任一项所述的方法，其中将所述aav颗粒通过鞘内、大脑内、实质内、脑室内、鼻内、耳内、眼内或眼周递送、静脉内递送(iv)或它们的任何组合递送或施用到所述受试者。

48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者先前已经接受了用血清型不是对应野生型第一aav血清型的血清型的aav颗粒进行的基因疗法治疗。

49.根据权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述aav颗粒的所述治疗有效量是约1×1012个病毒基因组(vg)/kg至约1×1014个vg/kg。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述aav颗粒的所述治疗有效量是约1×1012个vg/kg至约1×1013个vg/kg。