诱导痰单细胞悬液及其制备方法和应用

本发明涉及生物，具体是涉及诱导痰单细胞悬液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、诱导痰细胞学可以用于反映气道炎症类型，痰的检查对支气管哮喘、肺结核、支气管炎、肺吸虫病、肺部肿瘤等肺部疾病的诊断很有价值，对于指导气道慢性炎症疾病的临床治疗有较大价值。利用诱导痰细胞学分类，还可以判断在临床工作中药物的疗效。然而目前临床诱导痰细胞学检测以诱导痰细胞形态学为主，限制了对气道炎症细胞的进步认识，特别是炎症细胞内反应机制的进一步研究。

2、目前，诱导痰细胞基因表达的检测尚未有相关技术开发。

3、本发明通过开发诱导痰细胞的单细胞转录组方法学，有助于揭开诱导痰细胞基因表达，有助探究气道炎症发病机制及指导临床治疗。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提供一种诱导痰单细胞悬液及其制备方法和应用，本发明所制备得到的诱导痰单细胞悬液能够适用于单细胞转录组方法学检测。

2、实现上述目的的技术方案，包括如下。

3、本发明的第一目的，是提供一种诱导痰单细胞悬液制备方法，包括如下步骤：

4、1)获得待检测滤痰混悬液；

5、2)低温离心；

6、3)样本离心后去除上清液而不破坏细胞沉淀；

7、5)往细胞沉淀，加不含钙、镁离子的dpbs，轻轻地用移液管混合，反复倒置管使细胞球团重新悬浮；

8、6)过滤，用新的离心管收集滤过液；

9、7)对上步骤的收集的滤过液进行低温离心，去除上清液而不破坏细胞沉淀；

10、8)往上步骤细胞沉淀加适量不含钙、镁离子的dpbs(杜氏磷酸盐缓冲盐溶液)，轻轻地用移液管混合，轻轻吹吸10-15次或直到细胞完全悬浮；

11、9)调整悬液体积以获得目标细胞浓度，即得单细胞悬液。

12、在其中一些实施例中，所述低温离心的参数是：1200±10rpm，4℃，离心4-6min。

13、在其中一些实施例中，目标细胞浓度为700～1200cells/ul。

14、在其中一些实施例中，步骤6)中，过滤所用的过滤网的孔径为30±5um。

15、在其中一些实施例中，步骤6)中，使用过滤网时，应先用1ml不含钙、镁离子的dpbs先润湿过滤网，细胞悬液过滤完后，再往过滤网中加入500-1000ul的不含钙、镁离子的dpbs以尽量收集更多的滤过细胞。

16、本发明的第二目的，是提供通过任一上述方法制备得到的诱导痰单细胞悬液。

17、本发明的第三目的，是提供任一上述诱导痰单细胞悬液制备方法在诱导痰单细胞转录组测序方法中的应用。

18、本发明的第四目的，是提供一种诱导痰单细胞转录组测序方法。

19、一种诱导痰单细胞转录组测序方法，包括以下步骤：

20、按照上述任一上述方法制备得到的诱导痰单细胞悬液，

21、进行scrna-seq建库和测序。

22、在其中一些实施例中，所述scrna-seq建库和测序包括以下步骤：

23、a)gem生成和标签化；

24、对诱导痰单细胞悬液进行单细胞分离，并进行反转录实现标签化；

25、b)post gem-rt纯化和cdna扩增；

26、c)文库构建和定量；

27、d)对构建完成的文库测序。

28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过对诱导痰单细胞悬液进行制备，能够富集到大量的痰单细胞，使获得的诱导痰单细胞悬液可用于单细胞转录组测序，从而可以很好地检测痰细胞的基因表达情况，有助探究气道炎症发病机制及指导临床治疗，还可以用于支气管哮喘、肺结核、支气管炎、肺吸虫病、肺部肿瘤等肺部疾病的诊断，具有巨大的临床应用价值。

1.一种诱导痰单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低温离心的参数是：1200±10rpm，4℃，离心4-6min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，目标细胞浓度为700～1200cells/ul。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中，过滤所用的过滤网的孔径为30±5um。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中，使用过滤网时，应先用不含钙、镁离子的dpbs先润湿过滤网，细胞悬液过滤完后，再往过滤网中加入500-1000ul的不含钙、镁离子的dpbs以尽量收集更多的滤过细胞。

6.根据权利要求1-5任一项所述方法制备得到的诱导痰单细胞悬液。

7.根据权利要求1-5任一项所述诱导痰单细胞悬液的制备方法在诱导痰单细胞转录组测序方法中的应用。

8.一种诱导痰单细胞转录组测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的诱导痰单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述scrna-seq建库和测序包括以下步骤：