高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体及基因与应用

本发明属于基因工程与蛋白质改造，具体涉及高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体、基因及重组菌与应用。

背景技术：

1、甜味是人类最喜欢的口味之一，可以激活大脑中的奖赏系统，赋予消费者幸福感。随着生活水平的提高，消费者对甜味物质偏好性进一步增强。然而糖分过度摄入会引发疾病，比如龋齿、糖尿病、肥胖、代谢综合征等。因此，寻找一种安全高效的甜味剂对食品医药领域具有重要意义。

2、天然甜蛋白neoculin最初是从一种sphaerella种的果实中分离得到的小分子植物蛋白，具有安全健康、低热量、高甜度及高营养、可吸收的优点。此外，其还是甜味蛋白中唯一一个同时具有甜味和味觉修饰活性的蛋白，由两条链(nas和nbs，分别由113和114个氨基酸组成)通过两个二硫键连接。但该天然甜蛋白neoculin热稳定性差，限制了其商业化生产和应用。

3、蛋白质的热稳定性可以通过蛋白质的变性温度作为可视化指标来表征，变性温度tm越高代表蛋白质的稳定性越好。thermal shift assay实验技术可用于快速、高效地比较蛋白质的稳定性：蛋白质通常以native状态存在，加热会导致蛋白质转化为denatured状态从而暴露出疏水基团，暴露出的疏水基团可以与荧光染料sypro orange相结合，从而提高荧光染料的发射光，于是可以通过检测荧光强度来反映蛋白质的稳定性。

4、目前，亟需高温条件下稳定的甜蛋白。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体。

2、本发明的第二个目的是提供上述高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体的构建。

3、本发明的第三个目的是提供上述高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体在制备食品甜味剂中的应用。

4、本发明的技术方案概述如下：

5、高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体，所述甜蛋白neoculin包括nas链和nbs链，所述nas链和nbs链通过两个二硫键连接；所述nas链的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述nbs链的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述nas链的第27位天冬酰胺(n)突变成谷氨酸(e)+第51位谷氨酰胺(q)突变为天冬酰胺(n)+第70位甲硫氨酸(m)突变为丝氨酸(s)+第93位亮氨酸(l)突变为赖氨酸(k)+第95位缬氨酸(v)突变为半胱氨酸(c)，得到a链，所述a链的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述nbs链的第11位的组氨酸(h)突变为丙氨酸(a)+第74位的甘氨酸(g)突变为丙氨酸(a)+第78位的色氨酸(w)突变为丝氨酸(s)+第103位的丝氨酸(s)突变为半胱氨酸(c)+第106位的脯氨酸(p)突变为天冬氨酸(d)，得到b链，所述b链的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述a链的第95位的半胱氨酸和所述b链的第103位的半胱氨酸形成二硫键，得到高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体，所述高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体简称为fm。

6、高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体的构建，包括如下步骤：

7、1)构建a链的编码基因为a基因和构建b链的编码基因为b基因；

8、2)构建包含a基因的a重组表达载体和包含b基因的b重组表达载体；

9、3)构建包含所述a重组表达载体的a工程菌和包含所述b重组表达载体的b工程菌；

10、4)对所述a工程菌进行扩大培养和表达得到包涵体a-fm；对所述b工程菌进行扩大培养和表达得到包涵体b-fm，进行包涵体的纯化与变复性，对复性得到的蛋白进行纯化，得到高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体。

11、上述高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体在制备食品甜味剂中的应用。

12、本发明的优点

13、本发明基于结构分析和蛋白质稳定性计算辅助设计，对甜蛋白neoculin进行新的二硫键设计及定点突变设计，获得了高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体，与野生型甜蛋白neoculin相比，本发明的高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体的tm至少提高了20.3℃，并保持甜味。

1.高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体，所述甜蛋白neoculin包括nas链和nbs链，所述nas链和nbs链通过两个二硫键连接；所述nas链的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述nbs链的氨基酸序列如seq id no.2所示；其特征是所述nas链的第27位天冬酰胺突变成谷氨酸+第51位谷氨酰胺突变为天冬酰胺+第70位甲硫氨酸突变为丝氨酸+第93位亮氨酸突变为赖氨酸+第95位缬氨酸突变为半胱氨酸，得到a链，所述a链的氨基酸序列如seq idno.3所示；所述nbs链的第11位的组氨酸突变为丙氨酸+第74位的甘氨酸突变为丙氨酸+第78位的色氨酸突变为丝氨酸+第103位的丝氨酸突变为半胱氨酸+第106位的脯氨酸突变为天冬氨酸，得到b链，所述b链的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述a链的第95位的半胱氨酸和所述b链的第103位的半胱氨酸形成二硫键，得到高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体，所述高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体简称为fm。

2.高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体的构建，其特征是包括如下步骤：

3.权利要求2的高热稳定性的甜蛋白neoculin的突变体在制备食品甜味剂中的应用。