一种高催化活性的异丙醇脱氢酶突变体及其应用

本发明涉及酶工程和基因工程，特别涉及一种高催化活性的异丙醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术：

1、异丙醇脱氢酶(isopropanol dehydrogenase，idh)是一种以氧化型辅酶nad+或nadp+为受体、作用于供体ch-oh基团上的氧化还原酶，它在生物体内或生物技术应用中主要负责催化异丙醇(isopropylalcohol，ipa)的氧化脱氢反应，并将nad+或nadp+还原为nadh或nadph。

2、在工业技术中，辅酶的再生效率往往影响生物催化法的效率以及生产成本。如何提高反应过程中的辅酶高效再生循环是生物催化法需要解决的重要问题。目前辅酶再生体系包括葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等参与的辅酶再生体系。最常用的葡萄糖脱氢酶需要使用葡萄糖作为氢供体，氧化后产生的酸性物质积累过多会导致反应体系酶活下降，且反应体系成分复杂，分离纯化成本较高，工业应用价值不高。而异丙醇脱氢酶具有以下的优点：(1)异丙醇作为良好的共溶剂，可以提高疏水性底物在反应体系中的溶解度，不需要引入额外的共溶剂；(2)与葡萄糖脱氢酶的辅酶再生体系相比，反应生成的丙酮对反应体系酶活的影响较弱，且不需要调节ph，简化流程，反应体系相对简单，分离纯化的成本相对较低；(3)副产物丙酮沸点相对较低，容易除去，且丙酮具有一定工业价值，可回收再利用，降低生产成本。因此，发展异丙醇脱氢酶参与的辅酶再生体系具有一定的工业应用前景。但是现有异丙醇脱氢酶参与的辅酶再生体系中，氧化异丙醇并还原氧化型辅酶nad+生成nadh的辅酶再生体系中催化效率低。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是解决异丙醇脱氢酶参与的辅酶nadh再生体系中催化效率低的问题，通过对异丙醇脱氢酶底物结合口袋的氨基酸进行理性设计并进行分子改造，获得一类在氧化异丙醇并还原氧化型辅酶nad+生成nadh的辅酶再生体系中催化效率提高的高催化活性的异丙醇脱氢酶突变体；本发明的第二目的为提供所述异丙醇脱氢酶突变体在还原氧化型辅酶nad+为还原型辅酶nadh中的应用。

2、技术方案：本发明所述的高催化活性的异丙醇脱氢酶突变体，所述突变体是将seqid no.1所示氨基酸序列第18位、第91位、第143位这三个位点中至少有一个氨基酸进行置换；第18位异亮氨酸ile突变为亮氨酸leu，第91位丙氨酸ala突变为甘氨酸gly，第143位异亮氨酸ile突变为丙氨酸ala。

3、优选的，所述突变体包括i18l、a91g、i143a、i18l/a91g、i18l/i143a、a91g/i143a或i18l/a91g/i143a。

4、所述野生型异丙醇脱氢酶为ncbi gene id:wp_020944327.1对应的酶，源自acetobacter pasteurianus，氨基酸序列为seq id no.1，基因序列为：seq id no.2。

5、所述突变体i18l，即第18位异亮氨酸ile突变为亮氨酸leu。

6、所述突变体a91g，即第91位丙氨酸ala突变为甘氨酸gly。

7、所述突变体i143a，即第143位异亮氨酸ile突变为丙氨酸ala。

8、所述突变体i18l/a91g，即第18位异亮氨酸ile突变为亮氨酸leu且第91位丙氨酸ala突变为甘氨酸gly。

9、所述突变体i18l/i143a，即第18位异亮氨酸ile突变为亮氨酸leu且第143位异亮氨酸ile突变为丙氨酸ala。

10、所述突变体a91g/i143a，即第91位丙氨酸ala突变为甘氨酸gly且第143位异亮氨酸ile突变为丙氨酸ala。

11、所述突变体i18l/a91g/i143a，即第18位异亮氨酸ile突变为亮氨酸leu，第91位丙氨酸ala突变为甘氨酸gly和第143位异亮氨酸ile突变为丙氨酸ala。

12、本发明所述异丙醇脱氢酶突变体的编码基因通过如下方式获得：以来源于acetobacter pasteurianus野生型异丙醇脱氢酶基因的重组质粒pet22b-apidh为模板，利用定点突变引物进行pcr扩增，筛选目的突变基因。

13、本发明所述的基因为：编码所述的异丙醇脱氢酶突变体蛋白的基因。

14、本发明所述的重组质为：含有所述基因的重组质粒。

15、优选的，所述重组质粒的表达载体为pet系列表达载体。

16、本发明所述的种重组菌，携带所述突变体的基因或所述重组质粒。

17、优选的，所述宿主为大肠杆菌。

18、所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：

19、(1)构建重组质粒pet22b-apidh：将异丙醇脱氢酶基因apidh与酶切过的质粒pet22b进行连接，得到重组表达载体pet22b-apidh；

20、(2)构建重组菌e.coli bl21(de3)/pet22b-apidh：将构建好的重组表达载体pet22b-apidh热转入大肠杆菌bl21(de3)感受态中，培养筛选得到重组e.coli bl21(de3)/pet22b-apidh。

21、本发明所述的异丙醇脱氢酶突变体或所述重组质粒或所述的重组菌在还原氧化型辅酶nad+为还原型辅酶nadh中的应用。

22、所述应用包括如下步骤：以异丙醇脱氢酶突变体为催化剂，异丙醇为底物，催化氧化型辅酶nad+还原为还原型辅酶nadh。催化过程如下所示：

23、

24、优选的，所述的催化的反应温度为20～45℃，ph为6～10。

25、发明机理：经过深入广泛的研究，本发明提供了一种异丙醇脱氢酶及其制备方法和应用。具体而言，通过扩增来自acetobacter pasteurianus的异丙醇脱氢酶基因，并运用理性设计对其进行定向进化改造，最终获得了一种催化效率显著提高的异丙醇脱氢酶，从而实现还原型辅酶nadh的高效再生循环。

26、在本发明中，利用已公开报道的异丙醇脱氢酶的序列和结构信息，通过在ncbi等数据库中进行非冗余性检索，根据蛋白结构相似性、保守位点分析和宿主来源多样性等原则，筛选出一些潜在的酶基因。这些基因经过在大肠杆菌表达系统中的功能表达，随后进行纯化，得到了纯净的酶。优选的异丙醇脱氢酶源自acetobacter pasteurianus，其具备一定的催化活性，能够催化还原型辅酶nadh的再生。

27、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)通过对异丙醇脱氢酶的活性位点进行突变，最终获得的突变体提高了氧化型辅酶nad+还原为还原型辅酶nadh的再生效率；(2)突变体i18l/a91g/i143a的催化效率是野生型异丙醇脱氢酶的催化效率的2.1倍。

1.一种高催化活性的异丙醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体是将seq idno.1所示氨基酸序列第18位、第91位、第143位这三个位点中至少有一个氨基酸进行置换；第18位异亮氨酸ile突变为亮氨酸leu，第91位丙氨酸ala突变为甘氨酸gly，第143位异亮氨酸ile突变为丙氨酸ala。

2.根据权利要求1所述细胞色素异丙醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体包括i18l、a91g、i143a、i18l/a91g、i18l/i143a、a91g/i143a或i18l/a91g/i143a。

3.一种编码权利要求1～2任一项所述异丙醇脱氢酶突变体蛋白的基因。

4.一种含有权利要求3所述基因的重组质粒。

5.根据权利要求4所述重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pet系列表达载体。

6.一种携带权利要求3所述突变体的基因或权利要求4所述重组质粒的重组菌。

7.根据权利要求6所述重组菌，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。

8.一种权利要求1或2所述的异丙醇脱氢酶突变体或权利按要求4所述重组质粒或权利要求6所述的重组菌在还原氧化型辅酶nad+为还原型辅酶nadh中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：以异丙醇脱氢酶突变体为催化剂，氧化型辅酶nad+和异丙醇为底物，催化还原型辅酶nadh和副产物丙酮的生成。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的催化的反应温度为20～45℃，ph为6～10。