用于定量检测CHO细胞DNA片段大小分布的引物对及其应用的制作方法

本发明专利涉及一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的引物对及其应用，属于生物检测。

背景技术：

1、在上市和临床试验的生物药中，70％来自哺乳动物细胞表达体系，其中，哺乳动物cho细胞系是目前表达制备生物制品最广泛的宿主细胞，近几年仍将继续作为生产生物制品的主要宿主细胞。生物制品(如疫苗、抗体药物、基因药物等)在制备过程中，多使用传代细胞株进行生产，严格的纯化工艺可以去除一部分宿主细胞的dna片段，但产品中仍有可能会有残留杂质，这些宿主细胞残留dna可能会传递肿瘤或病毒相关基因，存在潜在的危险性。《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，康柏西普dna残留量≤30pg/mg，重组乙型肝炎疫苗(cho细胞)dna残留量应不高于10pg/剂。因此，cho宿主细胞dna检测项目是生物制品生产工艺中重要的质量检测指标之一。

2、相关研究表明，基因的大小普遍在200bp以上，因此大于200bp的残留dna片段可能会有一定的致病性，而且残留dna片段越大，生物制品的风险等级越高。因此，各国监管机构对其提出了严格要求。美国食品药品监督管理局(fda)关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出hcd(宿主细胞dna)的片段要小于200bp；2022年5月，国家药品监督管理局药品评审中心(cde)发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》中也明确指出需对dna残留量和残留片段大小进行控制，建议尽量将dna残留片段的大小控制在200bp以下。因此，定量检测使用cho宿主细胞表达抗体和重组蛋白，以及蛋白纯化过程中cho宿主细胞残留dna片段分布情况，有利于更好地对产品进行质量检测，进而降低生物制品中残留的cho宿主细胞dna片段的致病性。

3、目前，市场上主要的分析残留宿主细胞dna片段的方法是毛细管电泳的方法，研究者们开发了一种基于毛细管凝胶电泳与敏感激光诱导荧光(cge-lif)检测残留dna分子大小的方法，可以检测生物制品中残留dna的大小。实验表明，大多数宿主细胞残留dna片段大小为50～2000bp。除了毛细管电泳法外，市场上还存在基于qpcr进行生物制品中生产用细胞相关的dna片段检测的试剂盒，相比于cge-lif操作更简单，耗时更短。

4、由于国内外监管机构对于生物制品中宿主细胞dna的残留量和残留dna片段的大小分布等有强烈的关注，所以对cho细胞的残留dna片段残留量和残留片段大小的检测分析有着迫切的需求，但尚未见相关报道。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的引物对。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的引物对，至少包括以下描述的一组引物对：各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于seq id no:1所示区段，且其中一组引物对的扩增产物的长度在100bp以下，一组引物对的扩增产物的长度在100-199bp，一组引物对的扩增产物的长度在200-500bp，一组引物对的扩增产物的长度在500bp以上。

4、优选的，所述引物对是指第一引物对、第二引物对、第三引物对或第四引物对；

5、其中第一引物对的正向引物结合于seq id no:1所示序列的第113-156位；反向引物结合于seq id no:1所示序列的第184-221位，并且所述引物对的扩增产物的长度为90-98bp；

6、第二引物对的正向引物结合于seq id no:1所示序列的第101-156位；反向引物结合于seq id no:1所示序列的第184-221位，并且所述引物对的扩增产物的长度为105-120bp；

7、第三引物对的正向引物结合于seq id no:1所示序列的第101-156位；反向引物结合于seq id no:1所示序列的第282-320位，并且所述引物对的扩增产物的长度为200-220bp；

8、第四引物对的正向引物结合于seq id no:1所示序列的第37-153位；反向引物结合于seq id no:1所示序列的第526-638位，并且所述引物对的扩增产物的长度为500-557bp。

9、优选的，其中第一引物对包括seq id no:3所示的正向引物和seq id no:7所示的反向引物，扩增产物长度为92bp；

10、其中第二引物对包括seq id no:2所示的正向引物和seq id no:8所示的反向引物，扩增产物长度为115bp；

11、其中第三引物对包括seq id no:2所示的正向引物和seq id no:9所示的反向引物，扩增产物长度为204bp；

12、其中第四引物对包括seq id no:3所示的正向引物和seq id no:10所示的反向引物，扩增产物长度为511bp。

13、本发明还公开了一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的引物对组合，包括所述的引物对中的至少三对，更优选的，包括上述的第一引物对、第二引物对和第四引物对；或者上述的第一引物对、第三引物对和第四引物对；或者包括上述的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对。

14、本发明还公开了一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的试剂盒，包括上述的引物对或者引物对组合。

15、优选的，还包括探针。

16、优选的，所述探针的核苷酸序列如seq id no:15所示。

17、优选的，所述探针一端标记有荧光报告基团fam，另一端标记有淬灭基团bhq1。

18、试剂盒中还可以包括其他qpcr检测所需的试剂，例如酶、buffer等等。

19、本发明还公开了上述的引物对、引物对组合或上述的试剂盒在体外定量检测cho细胞dna片段大小分布中的应用。

20、本发明还公开了一种定量检测cho细胞dna片段大小分布的方法，以上述的引物对或引物对组合作为引物，对待测样品进行qpcr，并检测qpcr扩增产物；或者采用上述的试剂盒，对待测样品进行qpcr，并检测qpcr扩增产物。

21、优选的，待测样品来自基于cho细胞基质培育制备的疫苗、重组蛋白药、抗体药中的任意一种。

22、本发明的有益效果如下：

23、(1)本发明的目的是提供一种采用实时荧光定量pcr(real-time qpcr)技术定量检测cho残留dna片段的引物对及试剂，其能够用于分析生物制品中间品、成品中的cho残留dna片段，有利于改进工艺、提高产品质量，用于产品质量控制和放行。

24、(2)利用所述引物探针的qpcr检测方法操作简便快捷，从获得样品到给出检测报告只需3h；灵敏度高，定量限均为3fg/μl；专属性强，能区分小鼠基因组、e.coli、mdck细胞、hek293、vero细胞、毕赤酵母细胞等干扰性dna。

1.一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的引物对，其特征在于，至少包括以下描述的一组引物对：各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于seq id no:1所示区段，且其中一组引物对的扩增产物的长度在100bp以下，一组引物对的扩增产物的长度在100-199bp，一组引物对的扩增产物的长度在200-500bp，一组引物对的扩增产物的长度在500bp以上。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对是指第一引物对、第二引物对、第三引物对或第四引物对；

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，

4.一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的引物对组合，其特征在于，包括权利要求2或3中所述的引物对中的至少三对。

5.根据权利要求4所示的引物对组合，其特征在于，包括权利要求2或3中的第一引物对、第二引物对和第四引物对；或者包括权利要求2或3中所述的第一引物对、第三引物对和第四引物对；或者包括权利要求2或3中所述的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对。

6.一种用于定量检测cho细胞dna片段大小分布的试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述的引物对，或权利要求4或5所述的引物对组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括探针。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如seq id no:15所示。

9.产品在体外定量检测cho细胞dna片段大小分布中的应用，其中产品是指权利要求1-3中任一项所述的引物对，或权利要求4或5所述的引物对组合，或权利要求6-8中任一项所述的试剂盒。

10.一种定量检测cho细胞dna片段大小分布的方法，其特征在于，以权利要求1-3中任一项所述的引物对或权利要求4或5中所述的引物对组合作为引物，对待测样品进行qpcr，并检测qpcr扩增产物；或者采用权利要求6-8中任一项所述的试剂盒，对待测样品进行qpcr，并检测qpcr扩增产物。