一种用于不同变型天麻鉴定的PCR引物及其鉴定方法与应用

本发明涉及分子标记，具体涉及一种用于不同变型天麻鉴定的pcr引物及其鉴定方法与应用。

背景技术：

1、天麻是名贵中药材，为兰科植物天麻gastrodia elata bl.的干燥块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效，药用价值较高。天麻主要以人工栽培为主，常见栽培天麻有多种变型，包括红天麻gastrodia elata bl.f.elata，乌天麻gastrodia elatabl.f.glauca，绿天麻gastrodia elata bl.f.viridis，黄天麻gastrodia elatabl.f.flavida，以及近年来在云贵地区种植的血红天麻，因其茎色呈血红色而得名。乌天麻、绿天麻和血红天麻块茎在外观结构上相似，含水量低，块茎折干率高，是优良品种，适宜种植在高海拔地区；黄天麻和红天麻块茎在外观结构上相似，含水量高，折干率低，产量高，适应性广。不同变型天麻块茎不易区分，同时，市场上也存在根茎类伪品药材，影响天麻的品质和质量。

2、目前，关于天麻的鉴定方法主要有性状鉴定、分子鉴定，如已有研究(红天麻、乌天麻及其杂交天麻的pcr鉴别，李慧等，中国中药杂志)通过2对引物鉴定红天麻、乌天麻和杂交天麻，但缺乏对其他变型天麻的鉴定；已有研究(基于ssr-hrm技术的4种药用天麻变型遗传多样性及遗传结构分析，张俊等，中草药)分析了乌天麻、绿天麻、红天麻和黄天麻的遗传多样性，但尚未对4种天麻进行鉴别。因此，建立一种快速准确鉴别乌天麻、绿天麻、血红天麻、红天麻和黄天麻的方法对天麻育种和真伪鉴定具有重要的意义。

3、ssr(simple sequence repeats)标记是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，每个ssr两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。ssr分子标记广泛应用于种质资源评价、遗传多样性分析等研究。本研究基于ssr分子标记技术，通过建立乌天麻、绿天麻、血红天麻、红天麻、黄天麻的鉴定方法，可直接用于5种变型天麻的鉴别，为天麻的鉴定提供有力的技术支撑，推进天麻分子标记辅助选择育种。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种用于不同变型天麻鉴定的pcr引物。本发明的目的之二是提供一种用于不同变型天麻鉴定的pcr引物ch15、ch20在用于乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻鉴别中的应用。本发明的目的之三是提供一种鉴定乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻的方法。本发明的目的之四是提供一种鉴定乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻的方法在用于鉴定待测样品中是否含有乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻。

2、本发明是通过如下技术方案实现的：

3、本发明所述用于不同变型天麻鉴定的pcr引物，所述不同变型天麻为乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻，所述pcr引物包括ch15、ch20，各引物对应的核苷酸序列为：

4、1)引物ch15对应的核苷酸序列为：

5、f：5'-acatgtgttaagcatgccgc-3'；

6、r：5'-gggtatcccggtggtgta-3'；

7、2)引物ch20对应的核苷酸序列为：

8、f：5'-acctatgcctaagataccaggga-3'；

9、r：5'-agcccaatataaggtcgcgg-3'。

10、本发明所述pcr引物ch15、ch20在用于乌天麻、绿天麻、血红天麻、红天麻、黄天麻鉴别中的应用。

11、本发明所述pcr引物ch15、ch20还可以制备用于鉴定待测天麻为乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻或血红天麻的试剂盒；所述试剂盒的制法，包括将所述引物组合中各个引物分别单独包装的步骤。

12、上述试剂盒还包括pcr扩增的试剂，包括10×pcr buffer，dntp mixture，taq dna聚合酶。

13、上述试剂盒由上述引物组合以及进行pcr扩增的试剂组成。

14、本发明所述pcr引物鉴定乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻的方法，包括如下步骤：

15、1)以待测样品dna为模板，使用引物ch15、ch20进行pcr扩增；

16、2)以步骤1)的pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

17、本发明步骤1)中所述pcr扩增采用20μl体系：10×pcr buffer 2μl，dntp mixture0.5μl，easytaq dna聚合酶0.2μl，引物各0.4μl(浓度为10μm)，dna模板25-100ng，ddh2o补齐至20μl。

18、优选的，本发明dna模板50ng。

19、本发明所述pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；33个循环(95℃变型30s，52-61℃退火30s，72℃延伸45s)；72℃延伸5min。

20、优选的，本发明所述的pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；33个循环(95℃变型30s，58℃退火30s，72℃延伸45s)；72℃延伸5min。

21、本发明所述步骤2)对步骤1)的pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，乌天麻ch15引物在199bp处检测出条带，ch20引物在277bp处检测出条带；绿天麻ch15引物在199-300bp之间检测出条带，ch20引物在200-300bp之间检测出条带；红天麻ch15引物在150-199bp之间检测出条带，ch20引物在200-300bp之间检测出条带；黄天麻ch15引物在150-199bp之间检测出条带，ch20引物在300-400bp之间检测出条带；血红天麻的ch15引物在199bp处检测出条带，ch20引物在277-400bp之间检测出条带。

22、本发明产生的有益效果如下：

23、1.本发明鉴定得到2对pcr引物(ch15和ch20)，在血红天麻、乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻中均可以扩增出特异性主带，具有很好的重复性，是可靠有效的分子标记，本发明为天麻种质资源保护提供技术支撑。

24、2.本发明将天麻叶绿体基因组中筛选得到2对引物，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示：乌天麻ch15引物在199bp处检测出条带，ch20引物在277bp处检测出条带；绿天麻ch15引物在199-300bp之间检测出条带，ch20引物在200-300bp之间检测出条带；红天麻ch15引物在150-199bp之间检测出条带，ch20引物在200-300bp之间检测出条带；黄天麻ch15引物在150-199bp之间检测出条带，ch20引物在300-400bp之间检测出条带；血红天麻的ch15引物在199bp处检测出条带，ch20引物在277-400bp之间检测出条带。因此，ch15和ch20这2对引物可以鉴定出乌天麻、血红天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻，可以作为不同变型天麻的鉴定核心位点。

25、3.本发明应用ssr分子标记技术，提供了2对引物，作为乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻鉴定的核心引物，实现最大鉴别能力，构建了一种快速、准确的鉴定乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻的方法，为天麻的鉴定提供有力的技术支撑，推进天麻分子标记辅助选择育种。

26、4.本发明鉴定方法还可以鉴定出待测样品中是否含有乌天麻、绿天麻、红天麻、黄天麻、血红天麻。