基因组编辑的组合物和方法与流程

1.式i的构建体：

2.根据权利要求1所述的构建体，其具有式ii：

3.根据权利要求2所述的构建体，其具有式iia：

4.根据权利要求1所述的构建体，其具有式iii：

5.根据权利要求4所述的构建体，其具有式iiia：

6.根据权利要求4所述的构建体，其具有式iiib：

7.根据权利要求6所述的构建体，其具有式iiib-1：

8.根据权利要求4所述的构建体，其具有式iiic：

9.根据权利要求8所述的构建体，其具有式iiic-1：

10.根据权利要求8所述的构建体，其具有式iiic-2：

11.根据权利要求1所述的构建体，其具有式iv：

12.根据权利要求1-11中任一项所述的构建体，其中t包含(a)编码能够与抗体或其抗原结合片段结合的表位的多核苷酸，且还在(a)中的所述多核苷酸的3’末端包含(b)编码自切割肽的多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的构建体，其中编码所述自切割肽的所述核苷酸的3’末端还包含编码(c)能够与所述表位结合的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

14.根据权利要求1-11中任一项所述的构建体，其中所述t包含(a)编码能够与核苷酸序列元件结合的多肽序列的多核苷酸，且还在(a)中的所述多核苷酸的3’末端包含编码自切割肽的多核苷酸。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的构建体，其中所述自切割肽选自由t2a、p2a、e2a和f2a自切割肽组成的组。

16.根据权利要求15所述的构建体，其中所述自切割肽是t2a。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的构建体，其中所述dnmt3a包含seq id no:69的氨基酸序列。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的构建体，其中编码dnmt3a的多核苷酸包含seqid no:83的核酸序列。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的构建体，其中所述dnmt3l包括智人dnmt3l、小家鼠dnmt3l、卡氏小鼠dnmt3l、锡金小鼠dnmt3l、褐家鼠dnmt3l、黑家鼠dnmt3l、尼罗河草鼠dnmt3l、丛林鼠dnmt3l或白鼻乳鼠dntm3l。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的构建体，其中所述dnmt3l包含seq id no:74-82中任一项的氨基酸序列。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的构建体，其中编码dnmt3l的多核苷酸包含seqid no:84-92中任一项的核酸序列。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的构建体，其中所述krab包含seq id no:51、53或230-241的氨基酸序列。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的构建体，其中编码krab的所述多核苷酸包含seqid no:52、54、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226或228的核酸序列。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的构建体，其中所述基因表达调节剂包括kruppel相关抑制盒(krab)、zete同源物的增强子2(ezh2)、g9a、赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1a(lsd1)、异染色质蛋白1(hp1)、gata蛋白之友1(fog1)、组蛋白脱乙酰酶(hdac3)和/或dot1l。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述基因表达调节剂包含seq idno:51、53、55、57、59、61、63、65或67的氨基酸序列。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中编码所述基因表达调节剂的所述多核苷酸包含seq id no:52、54、56、58、60、62、64、66或68的核酸序列。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的构建体，其中所述dcas9包括金黄色葡萄球菌dcas9、化脓性链球菌dcas9、空肠弯曲杆菌dcas9、白喉棒状杆菌dcas9、凸腹真杆菌dcas9、巴氏链球菌dcas9、香肠乳杆菌dcas9、球形球毛壳菌dcas9、固氮螺菌属(例如，菌株b510)dcas9、重氮葡糖酸醋杆菌dcas9、灰奈瑟氏球菌dcas9、肠道罗斯拜瑞氏菌dcas9、食清洁剂细小棒菌dcas9、卤水硝酸盐裂解菌(例如菌株dsm 16511)dcas9、红嘴鸥弯曲杆菌(例如菌株cf89-12)dcas9、嗜热链球菌(例如菌株lmd-9)dcas9。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的构建体，其中所述dcas9包含seq id no:106-122中任一项的氨基酸序列。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的构建体，其中所述dcas9包含化脓性葡萄球菌dcas9。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的构建体，其中所述dcas9包含seq id no:1的氨基酸序列。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的构建体，其中dcas9的n-末端部分包含seq idno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的氨基酸序列。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的构建体，其中dcas9的c-末端部分包含seq idno:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25的氨基酸序列。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的构建体，其中编码所述dcas9的所述多核苷酸包含seq id no:26的核酸序列。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的构建体，其中编码所述dcas9的n-末端部分的所述多核苷酸包含seq id no:27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的氨基酸序列。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的构建体，其中编码所述dcas9的c-末端部分的所述多核苷酸包含seq id no:28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的构建体，其中能够与抗体或其抗原结合片段结合的所述表位选自由gcn4、t2a、10×gcn4和10xgfp-11组成的组。

37.根据权利要求36所述的构建体，其中所述gcn4包含seq id no:97的氨基酸序列。

38.根据权利要求37所述的构建体，其中编码所述gcn4的所述多核苷酸包含seq idno:101的核酸序列。

39.根据权利要求36-38中任一项所述的构建体，其中所述抗体或抗原结合片段是单结构域抗体、scfv、fab、vh、vhh或抗体模拟物。

40.根据权利要求39所述的构建体，其中所述抗原结合片段是scfv。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的构建体，其中能够与核酸结构元件结合的所述多肽序列选自由ms2噬菌体外壳蛋白(mcp)、pp7和pcp组成的组。

42.根据权利要求41所述的构建体，其中能够与核酸结构元件结合的所述多肽序列是mcp。

43.根据权利要求42所述的构建体，其中所述mcp包含seq id no:100的氨基酸序列。

44.根据权利要求42-43中任一项所述的构建体，其中编码所述mcp的多核苷酸包含seqid no:105的核酸序列。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的构建体，其中所述核酸结构元件是rna发夹基序。

46.根据权利要求45所述的构建体，其中所述rna发夹基序选自由ms2和pp7组成的组。

47.根据权利要求45-46中任一项所述的构建体，其中所述rna发夹基序是ms2 rna发夹基序。

48.根据权利要求47所述的构建体，其中所述ms2 rna发夹基序包含seq id no:104的核酸序列。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的构建体，所述构建体包含seq id no:162-189中任一项的核酸序列。

50.一种多肽，其由权利要求1-49中任一项所述的构建体表达。

51.一种载体，其包含权利要求1-49中任一项所述的构建体。

52.根据权利要求51所述的载体，所述载体还包含编码单一引导rna(sgrna)的多核苷酸。

53.根据权利要求51-52中任一项所述的载体，其中编码sgrna的多核苷酸还包含2-20个拷贝的所述核酸结构元件。

54.一种细胞，其包含权利要求1-49中任一项所述的构建体。

55.一种细胞，其包含权利要求50所述的多肽。

56.一种细胞，其包含权利要求51-53中任一项所述的载体。

57.根据权利要求54到56中任一项所述的细胞，所述细胞还包含至少一种sgrna。

58.根据权利要求57所述的细胞，其中所述至少一种sgrna还包含2-20个拷贝的所述核酸结构元件。

59.一种组合物，其包含权利要求1-49中任一项所述的构建体。

60.一种组合物，其包含权利要求50所述的多肽。

61.一种组合物，其包含权利要求51-53中任一项所述的载体。

62.根据权利要求59-61中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种sgrna。

63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述sgrna还包含2-20个拷贝的所述核酸结构元件。

64.根据权利要求59-63中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

65.权利要求1-48中任一项所述的构建体或由所述构建体表达的多肽在制备用于在细胞群中改变基因产物的表达并使脱靶修饰最小化的试剂的用途，所述改变是通过包括向所述细胞群中引入以下物质的步骤：

66.根据权利要求65所述的用途，

67.根据权利要求66所述的用途，所述改变还通过向所述细胞引入：

68.根据权利要求65所述的用途，

69.根据权利要求68所述的用途，所述改变还通过向所述细胞引入：

70.权利要求1-48中任一项所述的构建体或由所述构建体表达的一种或多种多肽在制备用于体内减少或消除受试者中基因产物表达的药物的用途，所述减少或消除是通过包括向所述受试者的细胞中引入以下物质的步骤：

71.权利要求1-49中任一项所述的构建体或由所述构建体表达的一种或多种多肽在制备用于治疗或减轻受试者的基因产物相关病症的症状的药物的用途，所述治疗或减轻是通过包括向所述受试者的细胞中引入以下物质的步骤：

72.根据权利要求65-69中任一项所述的用途，其中与野生型细胞群相比，所述基因产物在所述多个经修饰的细胞中的表达减少50-100％。

73.根据权利要求65-69中任一项所述的用途，其中所述基因产物的中靶修饰与所述基因产物的脱靶修饰之比为约10∶1。

74.根据权利要求65-73中任一项所述的用途，其中至少一个核苷酸的修饰是dna甲基化或组蛋白修饰。

75.根据权利要求74所述的用途，其中至少一个核苷酸的修饰是dna甲基化。

76.根据权利要求65-75中任一项所述的用途，其中所述基因的调控元件是核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘体元件、边界元件或基因座控制区。

77.根据权利要求65-76中任一项所述的用途，其中所述基因附近和/或所述基因调节元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述基因的转录起始位点上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp内。

78.根据权利要求65-76中任一项所述的用途，其中所述基因附近和/或所述基因调节元件内的至少一个核苷酸的修饰位于所述基因的转录起始位点下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp内。

79.根据权利要求65-78中任一项所述的用途，其中所述构建体是脱氧核糖核酸(dna)。

80.根据权利要求65-78中任一项所述的用途，其中所述构建体是信使核糖核酸(mrna)。

81.根据权利要求65-80中任一项所述的用途，其中所述构建体被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。

82.根据权利要求65-80中任一项所述的用途，其中所述构建体和所述sgrna被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。

83.根据权利要求82所述的用途，其中所述构建体和所述sgrna被配制在相同的脂质体或脂质纳米颗粒中。

84.根据权利要求82所述的用途，其中所述构建体和所述sgrna被配制在不同的脂质体或脂质纳米颗粒中。

85.根据权利要求81-84中任一项所述的用途，其中所述脂质体或脂质纳米颗粒包含可电离脂质(20％-70％，摩尔比)、聚乙二醇化脂质(0％-30％，摩尔比)、支撑脂质(30％-50％，摩尔比)和胆固醇(10％-50％，摩尔比)。

86.根据权利要求85所述的用途，其中可电离脂质选自由ph响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质组成的组。

87.根据权利要求65-80中任一项所述的用途，其中所述构建体被配制在aav载体中。

88.根据权利要求65-80中任一项所述的用途，其中所述构建体和所述sgrna被配制在aav载体中。

89.根据权利要求88所述的用途，其中所述构建体和所述sgrna被配制在相同的aav载体中。

90.根据权利要求88所述的用途，其中所述构建体和所述sgrna被配制在不同的aav载体中。

91.根据权利要求65-90中任一项所述的用途，所述试剂或药物通过局部注射、全身输注或其组合将所述构建体或由所述构建体表达的一种或多种多肽递送至所述细胞。

92.根据权利要求65-91中任一项所述的用途，其中所述基因产物选自由以下组成的组：vegfa基因产物、pcsk9基因产物、angptl3基因产物、ptbp1基因产物、ttr基因产物、ube3a-ats基因产物、ptp1b基因产物、apoc3基因产物、hsd17b13基因产物、bcl11a基因产物和tgf-β基因产物。

93.根据权利要求70-92中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

94.根据权利要求67-92中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗或预防选自由以下疾病或病症组成的组：家族性高胆固醇血症(fh)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、帕金森病、肝纤维化(hf)、年龄相关性黄斑病(amd)、安格尔曼综合征(as)、ii型糖尿病、β-地中海贫血和肝细胞癌。