基因组编辑的组合物和方法与流程

本公开总体上涉及分子生物学、免疫学和医学领域。更具体地，其涉及用于体内基因产物的靶向减少或消除的基于crispr/cas9的融合分子及其使用方法。

背景技术：

1、可被定制来靶向哺乳动物细胞中的任何基因的工程化的dna结合蛋白使得生物医学研究取得了快速进展，并且是基因疗法的有前景的平台。rna引导的crispr-cas9系统已经成为可编程靶向基因调控的有前景的平台。无催化活性的“死”cas9 (dcas9)与kruppel相关盒(krab)结构域的融合产生了合成阻遏物，其能够在细胞培养实验中高度特异和高效地调节或沉默靶基因。

2、然而，使用合成的dcas9-krab融合蛋白持续调节和沉默内源基因对在体内疗法中的应用提出了挑战。合成阻遏物超过了病毒载体递送方法的包装尺寸限制。安全性、毒性、免疫原性和脱靶效应是限制合成阻遏物在体内使用的其它挑战。本领域需要用于产生遗传工程合成的基因阻遏物的替代方法，以及用作治疗剂的合成基因阻遏物的体内递送。本公开解决了现有技术中未满足的需求。

技术实现思路

1、本公开提供了式i的构建体：5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-e-3’ (i)，其中：a和b之一是编码dnmt3a或其部分的多核苷酸；a和b中的另一个是编码dnmt3l或其部分的多核苷酸；casn是编码dcas9的n-末端部分的多核苷酸；casc是编码dcas9的c-末端部分的多核苷酸；e是5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’ or 5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’；k是编码krab或其部分的多核苷酸；d是编码基因表达调节剂的多核苷酸；t包含编码(i)能够结合抗体或其抗原结合片段的表位或(ii)能够结合核酸结构元件的多肽序列的多核苷酸；m1、m2、m3、m4、m5和m6各自独立地是选自0至3的整数；n1、n2和n3各自独立地是选自0至2的整数；p是选自0至20的整数；q是选自0至5的整数；r是选自0至5的整数；并且其中当p为0时，m1、m2、m3和m4中的至少一个不为0，n1和n2中的至少一个不为0，并且q和r中的至少一个不为0。

2、在一些实施方案中，构建体包含式ii：5’-casn-(am3-bm4)n2-casc-kr-dq-3’(ii)，其中：n2是选自1和2的整数；r是选自1至5的整数；q是选自0至5的整数；并且m3和m4中的至少一个不为0。在一些实施方案中，构建体包含式iia：5’-casn-(a-b)-casc-kr-dq-3’ (iia)。

3、在一些实施方案中，构建体包含式iii：5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-e-3’(iii)，其中p是选自1至20的整数。在一些实施方案中，构建体包含式iiia：5’-casn-casc-tp-3’ (iiia)。

4、在一些实施方案中，构建体包含式iiib：5’-(am1-bm2)-casn-casc-tp-e-3’(iiib)，其中m1和m2中至少一个不为0。在一些实施方案中，所述构建体包含式iiib-1：5’-(a-b)-casn-casc-tp-kr-dq-3’ (iiib-1)，其中：r是选自1至5的整数；并且q是选自0至5的整数。

5、在一些实施方案中，构建体包含式iiic：5’-casn-casc-tp-e-3’(iiic)，其中：n3是选自1和2的整数；r是选自1至5的整数；并且q是选自0至5的整数；并且m5和m6中的至少一个不为0。在一些实施方案中，所述构建体包含式iiic-1：5’-casn-casc-tp-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’(iiic-1)。在一些实施方案中，所述构建体包含式iiic-2：5’-casn-casc-tp-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’ (iiic-2)。

6、在一些实施方案中，t包含(a)编码能够结合抗体或其抗原结合片段的表位的多核苷酸，并且还在(a)中多核苷酸的3’末端包含(b)编码自切割肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码自切割肽的核苷酸的3’末端还包含编码(c)能够结合表位的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

7、在一些实施方案中，t包含(a)编码能够结合核苷酸序列元件的多肽序列的多核苷酸，并且还在(a)中多核苷酸的3’末端包含编码自切割肽的多核苷酸。

8、在一些实施方案中，自切割肽选自由t2a、p2a、e2a和f2a自切割肽组成的组。在一些实施方案中，自切割肽是t2a。在一些实施方案中，t2a包含seq id no: 99的氨基酸序列。

9、在一些实施方案中，dnmt3a包含seq id no: 69的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码dnmt3a的多核苷酸包含seq id no: 83的核酸序列。

10、在一些实施方案中，dnmt3l包括智人dnmt3l、小家鼠dnmt3l、卡氏小鼠( mus  caroli) dnmt3l、锡金小鼠( mus pahari) dnmt3l、褐家鼠( rattus norvegicus) dnmt3l、黑家鼠( rattus rattus) dnmt3l、尼罗河草鼠( arvicanthis niloticus) dnmt3l、丛林鼠( grammomys surdaster) dnmt3l或白鼻乳鼠( mastomys coucha) dntm3l。在一些实施方案中，dnmt3l包含seq id no: 74-82中的任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码dnmt3l的多核苷酸包含seq id no: 84-92中的任一项的核酸序列。

11、在一些实施方案中，krab包含seq id no: 51、53或230-241的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码krab的多核苷酸包含seq id no: 52、54、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226或228的核酸序列。

12、在一些实施方案中，基因表达调节剂包含kruppel相关抑制盒(krab)、zete同源物的增强子2 (ezh2)、g9a、赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1a (lsd1)、异染色质蛋白1 (hp1)、gata蛋白之友1 (friend of gata protein 1)(fog1)、组蛋白脱乙酰酶(hdac3)和/或dot1l。在一些实施方案中，基因表达调节剂包含seq id no: 51、53、55、57、59、61、63、65或67的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码基因表达调节剂的多核苷酸包含seq id no:52、54、56、58、60、62、64、66或68的核酸序列。

13、在一些实施方案中，dcas9包括金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)dcas9、化脓性链球菌( streptococcus pyogenes)dcas9、空肠弯曲杆菌( campylobacter  jejuni) dcas9、白喉棒状杆菌( corynebacterium diphtheria) dcas9、凸腹真杆菌( eubacterium ventriosum) dcas9、巴氏链球菌( streptococcus pasteurianus) dcas9、香肠乳杆菌( lactobacillus farciminis) dcas9、球形球毛壳菌( sphaerochaeta globus)dcas9、固氮螺菌属( azospirillum )(例如，菌株b510) dcas9、重氮葡糖酸醋杆菌( gluconacetobacter diazotrophicus) dcas9、灰奈瑟氏球菌( neisseria cinerea)dcas9、肠道罗斯拜瑞氏菌( roseburia intestinalis) dcas9、食清洁剂细小棒菌( parvibaculum lavamentivorans) dcas9、卤水硝酸盐裂解菌( nitratifractor  salsuginis)(例如菌株dsm 16511) dcas9、红嘴鸥弯曲杆菌( campylobacter lari)(例如菌株cf89-12) dcas9、嗜热链球菌( streptococcus thermophilus)(例如菌株lmd-9)dcas9。在一些实施方案中，dcas9包含seq id no: 106-122中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码dcas9的多核苷酸包含seq id no: 26的核酸序列。

14、在一些实施方案中，dcas9包含seq id no: 1的氨基酸序列。在一些实施方案中，dcas9的n-末端部分包含seq id no: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24的氨基酸序列。在一些实施方案中，dcas9的c-末端部分包含seq id no: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25的氨基酸序列。

15、在一些实施方案中，编码dcas9的多核苷酸包含seq id no: 26的核酸序列。在一些实施方案中，编码dcas9的n-末端部分的多核苷酸包含seq id no: 27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码dcas9的c-末端部分的多核苷酸包含seq id no: 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的核酸序列。

16、在一些实施方案中，能够结合抗体或其抗原结合片段的多肽选自由gcn4、t2a、10xgcn4和10×gfp-11组成的组。在一些实施方案中，gcn4包含seq id no: 97的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码gcn4的多核苷酸包含seq id no: 101的核酸序列。

17、在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单结构域抗体、scfv、fab、vh、vhh或抗体模拟物。在一些实施方案中，抗原结合片段是scfv。

18、在一些实施方案中，能够结合核酸结构元件的多肽序列选自由ms2噬菌体外壳蛋白(mcp)、pp7和pcp组成的组。在一些实施方案中，能够结合核酸结构元件的多肽序列是mcp。在一些实施方案中，mcp包含seq id no: 100的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码mcp的多核苷酸包含seq id no: 105的核酸序列。

19、在一些实施方案中，核酸结构元件是rna发夹基序。在一些实施方案中，rna发夹基序选自由ms2和pp7组成的组。在一些实施方案中，rna发夹基序是ms2 rna发夹基序。在一些实施方案中，ms2 rna发夹基序包含seq id no: 104的核酸序列。

20、在一些实施方案中，构建体包含seq id no: 134-162的核酸序列。

21、本公开提供了由本文所述的任一种构建体表达的多肽。本公开提供了包含本文描述的任一种构建体的载体。

22、在一些实施方案中，载体还包含编码单一引导rna (sgrna)的多核苷酸。在一些实施方案中，编码sgrna的多核苷酸还包含2-20个拷贝的核酸结构元件。

23、本公开提供了包含本文所述的任一种构建体的细胞。本公开提供了包含本文所述的任一种多肽的细胞。本公开提供了包含本文所述的任一种载体的细胞。

24、在一些实施方案中，细胞还包含至少一种sgrna。在一些实施方案中，所述至少一种sgrna还包含2-20个拷贝的核酸结构元件。

25、本公开提供了包含本文所述的任一种构建体的组合物。本公开提供了包含本文所述的任一种多肽的组合物。本公开提供了包含本文所述的任一种载体的组合物。

26、在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种sgrna。在一些实施方案中，所述sgrna还包含2-20个拷贝的核酸结构元件。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

27、本公开提供了在细胞群中改变基因产物的表达并使脱靶修饰最小化的方法，其包括向细胞群中引入以下物质的步骤：i)本文所述的任一种构建体或由该构建体表达的一种或多种多肽；和ii)至少一种sgrna，其中krab和/或基因表达调节剂提供基因附近和/或基因调控元件内至少一个核苷酸的修饰，从而改变基因产物的表达。

28、在一些实施方案中，(a)包含式i的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iii的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iiib的5’-(am1-bm2)-casn-casc-tp-3’ 部分、式iiib-1的5’-(a-b)-casn-casc-tp-3’ 部分、式iiic的5’-casn-casc-tp-3’部分、式iiic-1的5’-casn-casc-tp-3’部分、式iiic-2的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽以及ii)的sgrna被募集到基因组基因座上，和(b)多拷贝的包含式i的5’-e-3’部分、式iii的5’-e-3’部分、式iiib的5’-e-3’部分、式iiib-1的5’-kr-dq-3’部分、式iiic的5’-e-3’部分、式iiic-1的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’部分或式iiic-2的5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’ 部分的i)的多肽通过抗体或其抗原结合片段与表位的结合而被募集到基因组基因座上，从而将由构建体表达的多肽募集到基因组基因座上，并改变细胞群中基因产物的表达。

29、在一些实施方案中，该方法还包括向细胞引入：iii)包含e的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’ or 5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’的第二构建体或由第二构建体表达的多肽，其中包含式iiia的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽和sgrna被募集到基因组基因座上，其中多拷贝的iii)的多肽通过抗体或其抗原结合片段与表位的结合而被募集到基因组基因座上，从而将由i)的构建体和iii)的构建体表达的多肽募集到基因组基因座上，并改变细胞群中基因产物的表达。

30、在一些实施方案中，(a)包含式i的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iii的5’-(am1-bm2)n1-casn-(am3-bm4)n2-casc-tp-3’部分、式iiib的the 5’-(am1-bm2)-casn-casc-tp-3’ 部分、式iiib-1的5’-(a-b)-casn-casc-tp-3’部分、式iiic的5’-casn-casc-tp-3’部分、式iiic-1的5’-casn-casc-tp-3’部分或式iiic-2的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽以及ii)的sgrna被募集到基因组基因座上，以及(b)多拷贝的包含式i的5’-e-3’部分、式iii的5’-e-3’部分、式iiib的5’-e-3’部分、式iiib-1的5’-kr-dq-3’部分、式iiic的5’-e-3’部分、式iiic-1的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’部分或式iiic-2的5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’ 部分的i)的多肽通过能够与核酸结构元件结合的多肽序列与所述核酸结构元件的结合而被募集到基因组基因座上，从而将由构建体表达的多肽募集到基因组基因座上，并改变细胞群中基因产物的表达。

31、在一些实施方案中，该方法还包括向细胞引入：iii)包含e的5’-(am5-bm6)n3-kr-dq-3’或5’-kr-dq-(am5-bm6)n3-3’部分的第二构建体或由第二构建体表达的多肽，其中包含式iiia的5’-casn-casc-tp-3’部分的i)的多肽和sgrna被募集到基因组基因座，其中多拷贝的iii)的多肽通过能够与核酸结构元件结合的多肽序列与所述核酸结构元件的结合而被募集到基因组基因座上，从而将由构建体表达的多肽募集到基因组座位上，并改变细胞群中基因产物的表达。

32、本公开提供了减少或消除受试者中基因产物表达的体内方法，其包括向受试者的细胞中引入以下物质的步骤：i)本文所述的任一种构建体或由该构建体表达的一种或多种多肽；和ii)至少一种sgrna，其中krab和/或基因表达调节剂提供基因附近和/或基因调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，从而改变受试者中基因产物的表达。

33、本公开提供了用于治疗或减轻受试者的基因产物相关病症的症状的方法，其包括向受试者的细胞引入以下物质的步骤：i)本文所述的任一种构建体或由该构建体表达的一种或多种多肽；和ii)至少一种sgrna，其中krab和/或基因表达调节剂提供基因附近和/或基因调控元件内的至少一个核苷酸的修饰，从而改变基因产物的表达并治疗或减轻受试者的基因产物相关病症的症状。

34、在一些实施方案中，与野生型细胞群相比，基因产物在多个经修饰的细胞中的表达降低了50-100%。在一些实施方案中，基因产物的中靶修饰(on-site modification)与基因产物的脱靶修饰(off-site modification)的比率为约10:1。

35、在一些实施方案中，至少一个核苷酸的修饰是dna甲基化或组蛋白修饰。在一些实施方案中，至少一个核苷酸的修饰是dna甲基化。

36、在一些实施方案中，基因调控元件是核心启动子、近端启动子、远端增强子、沉默子、绝缘体元件(insulator element)、边界元件(boundary element)或基因座控制区。

37、在一些实施方案中，基因附近和/或基因调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于基因转录起始位点上游约100 bp、约200 bp、约300 bp、约400 bp、约500 bp、约600bp、约700 bp、约800 bp、约900 bp、约1000 bp、约1100 bp、约1200 bp、约1300 bp、约1400 bp或约1500 bp内。

38、在一些实施方案中，基因附近和/或基因调控元件内的至少一个核苷酸的修饰位于基因转录起始位点下游约100 bp、约200 bp、约300 bp、约400 bp、约500 bp、约600bp、约700 bp、约800 bp、约900 bp、约1000 bp、约1100 bp、约1200 bp、约1300 bp、约1400 bp或约1500 bp内。

39、在一些实施方案中，构建体是脱氧核糖核酸(dna)。在一些实施方案中，构建体是信使核糖核酸(mrna)。在一些实施方案中，构建体被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，构建体和sgrna被配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，构建体和sgrna被配制在相同的脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，构建体和sgrna被配制在不同的脂质体或脂质纳米颗粒中。

40、在一些实施方案中，脂质体或脂质纳米颗粒包含可电离脂质(20%-70%，摩尔比)、聚乙二醇化脂质(0%-30%，摩尔比)、支撑脂质(30%-50%，摩尔比)和胆固醇(10%-50%，摩尔比)。在一些实施方案中，可电离脂质选自ph响应性可电离脂质、热响应性可电离脂质和光响应性可电离脂质。

41、在一些实施方案中，构建体被配制在aav载体中。在一些实施方案中，构建体和sgrna被配制在aav载体中。在一些实施方案中，构建体和sgrna被配制在相同的aav载体中。在一些实施方案中，构建体和sgrna被配制在不同的aav载体中。

42、在一些实施方案中，通过局部注射、全身输注或其组合将构建体或由构建体表达的一种或多种多肽递送至细胞。

43、在一些实施方案中，基因产物选自由以下组成的组：vegfa基因产物、pcsk9基因产物、angptl3基因产物、ptbp1基因产物、ttr基因产物、ube3a-ats基因产物、ptp1b基因产物、apoc3基因产物、hsd17b13基因产物、bcl11a基因产物和tgf-β基因产物。

44、在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：家族性高胆固醇血症(fh)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、帕金森病、肝纤维化(hf)、年龄相关性黄斑病(amd)、安格尔曼综合征(as)、ii型糖尿病、β-地中海贫血和肝细胞癌。