一种靶向CD37的嵌合抗原受体（CAR）及其抗癌的用途的制作方法

本发明属于生物技术研发领域，具体提供了一种靶向cd37的嵌合抗原受体(car)及其抗癌的用途。

背景技术：

1、自2017年首次获得美国食品药品监督管理局(fda)批准以来，嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法已成为治疗b细胞恶性肿瘤(包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤(mm))的主要武器。迄今为止，美国已批准了六种针对cd19或b细胞成熟抗原(bcma)的产品(参见cappell,k.m.,and kochenderfer j.n.long-term outcomes following car t celltherapy:what we know so far.nat.rev.clin.oncol.2023,20:359–371)，还有大量正在进行的试验正在评估针对血液系统恶性肿瘤和实体瘤的其他候选药物(参见wang,x.,andrivière i..manufacturing of car-t cells:the assembly line.in gene andcellular immunotherapy for cancer.ghobadi a.,anddipersio j.f.,editor.humana,cham,switzerland.2022,121–139)。此外，cd19 car-t细胞疗法最近已应用于治疗自身免疫性疾病，早期数据显示系统性红斑狼疮患者的结果令人鼓舞(参见mackensen,a.,müllerf.,mougiakakos d.,et al.anti-cd19 car t cell therapy for refractory systemiclupus erythematosus.nat.med.2022,28:2124–2132)

2、相比于b细胞恶性肿瘤，t细胞恶性肿瘤也是临床上常见的血液肿瘤，其中t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)约占成人all的25％，占儿童all的10-15％。t-all源于t细胞发育过程中胸腺祖细胞通过积累基因异常而发生的白血病转化。过去三十年来，all(包括t-all)的治疗取得了显著进展，总体生存率持续提高，尤其是15岁以下儿童，然而成年t-all患者的生存率明显低于儿童和年轻人，复发/难治性疾病患者的预后较差，生存率为10-25％(参见duvall as,sheade j,anderson d,et al.updates in the management ofrelapsed and refractory acute lymphoblastic leukemia:an urgent plea for newtreatment inbeing answered.jco oncol pract.2022,18:479–487)。car-t细胞疗法在治疗b细胞恶性肿瘤方面取得了相当大的成功，这些在治疗多种血液系统恶性肿瘤方面的进展引发了对car-t细胞疗法在t细胞恶性肿瘤中的探索，然而将car-t细胞疗法扩展到t细胞恶性肿瘤尤其具有挑战性，因为正常细胞和恶性细胞之间许多细胞膜抗原靶点的共同表达(参见liu j,zhang y,guo r,et al.targeted cd7 car t-cells for treatment of t-lymphocte leukemia and lymphoma and acute myeloid leukemia:recentadvances.fron immunol.2023,14:1170968)。

3、因此，抗肿瘤靶点的选择对于t细胞肿瘤治疗至关重要。常见的靶点包括cd7、cd5等，但是由于cd7、cd5在正常t淋巴细胞和nk细胞上表达，t淋巴细胞细胞膜上未受抑制的cd7表达将导致自相残杀，因此必须阻断t细胞膜上相关基因的表达，如基因编辑、蛋白质阻断剂和自然选择等。例如，利用crispr/cas9基因编辑系统敲除cd7基因，可防止自相残杀，并对恶性t白血病细胞发挥特定的抗肿瘤活性(参见gomes-silva d,srinivasan m,sharmas,et al.cd7-edited t cells expressing a cd7-specific car for the therapy oft-cell malignancies.blood.2017,130:285–296)；wong等使用cd7蛋白阻断剂开发出cd7和cd3表达均被耗尽的抗cd7 car-t细胞(pcart7)，该细胞对t-all和t淋巴瘤细胞表现出强大的细胞毒性，该蛋白质阻断剂由单链可变片段和细胞内保留域组成，在靶抗原发生蛋白水解降解之前将其锚定在内质网和高尔基体中，可下调t细胞中的cd7表达，而无需进行cd7基因编辑(参见wong xfa,ng j,zheng s,et al.development of an off-the-sh elfchimeric antigen receptor(car)-t cell therapy for t-cell acute lymphoblasticleukemia(t-all)without gene editing.blood.2022,140(suppl 1):2358–2359)。

4、上述方式虽然能够获得可有效治疗t细胞恶性肿瘤的car-t细胞，但是需要采用复杂受到阻断t细胞膜上目标蛋白的表达，制备过程过于繁琐，生产成本大大提高，且不利于临床使用，使得治疗效果大打折扣。相比于cd7和cd5，cd37是最近新发现的治疗t细胞恶性肿瘤的治疗靶点，它是四跨膜蛋白超家族的跨膜蛋白，部分t细胞淋巴瘤在其细胞膜上表达cd37，靶向cd37的car-t在使用过程中未观察到显著的自相残杀相关事件(参见chun i,kimkh,chiang yh,et al.crispr-cas9 knock out ofcd5 enhances the antitumoractivity of chiemeric antigen receptor t cells.blood.2020,136(suppl 1):51–52.)，因此其有希望成为一种有效的t细胞恶性肿瘤治疗靶点。但是目前对于cd37的cat-t细胞研究较少，仅一项研究进入了临床实验阶段(nct 04136275)，涉及血液系统恶性肿瘤，包括白血病、b细胞和t细胞淋巴瘤(参见frigault mj,chen yb,gallagher k,et al.phase1study ofcd37-directed car t cells in patients with relapsed or refractorycd37+hematologic malignancies.blood.2021,138(suppl1):653)。

5、有鉴于此，本发明开发了一种靶向cd37的car-t细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用，可有效识别目标细胞，防止car-t细胞自相攻击，有效抑制肿瘤细胞生长。

6、t细胞活化对于细胞制造过程的成功至关重要，因为它直接影响car转基因整合的效率以及体外培养期间的t细胞扩增。t细胞活化最常见的方法是通过cd3和cd28刺激结合细胞因子支持来实现。cd3信号传导(信号1)触发t细胞活化，而cd28信号传导提供必要的共刺激(信号2)以避免免疫细胞无效。但是在临床实践中发现，cd28共刺激难以产生持续性的疗效，car-t在体内快速代谢和清除，不利于抗肿瘤作用的发挥，还可能导致肿瘤复发等现象，限制了car-t细胞的临床应用。

7、鉴于，靶向cd37的car-t存在的一些缺点和不足，本发明中获得了亲和力较高的靶向cd37的scfv结构，并对car结构进行改造，引入il-21结构域，可提高car-t细胞抗肿瘤活性，抑制t细胞衰竭，有效治疗肿瘤疾病。

技术实现思路

1、本发明中的第一方面提供了一种靶向cd37的嵌合抗原受体car，所述嵌合抗原受体，包括信号肽、anti cd37 scfv、铰链区、跨膜区、共刺激因子和cd3ζ信号域，所述anticd37 scfv包括氨基酸序列如seq id no:1所示重链可变区和氨基酸序列如seq id no:2所示轻链可变区。

2、进一步的，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no:3所示。

3、进一步的，所述共刺激因子为cd28，其氨基酸序列如seq id no:6所示。

4、进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:8所示。

5、进一步的，所述嵌合抗原受体还包括il-21结构域，所述il-21的氨基酸序列如seqid no:9所示。

6、进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:10所示。

7、本发明中的第二方面提供了一种car-t细胞，所述car-t细胞表达所述的嵌合抗原受体。

8、本发明中的第三方面提供了一种所述的嵌合抗原受体和/或所述的car-t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

9、进一步的，所述肿瘤为t细胞恶性肿瘤。

10、进一步的，所述肿瘤为t细胞急性淋巴细胞白血病t-all。

11、有益效果

12、本发明提供了一种靶向cd37的嵌合抗原受体(car)及其抗癌的用途，具体如下有益效果：

13、(1)选择cd37为目标靶点构建car，并提供了具有全新氨基酸结构的anti cd37scfv，能够靶向识别目标抗原；

14、(2)对于抗原结合域进行了人源化改造，降低抑制抗宿主反应，并能够维持较长的细胞激活时间；

15、(3)在car结构中增加il-21结构域，可有效维持t细胞的激活状态；

16、(4)本发明所提供的car-t细胞在体内、体外均能有效抑制肿瘤细胞生长。