玉米ZmER1基因在提高玉米穗腐病抗性中的应用的制作方法

本发明属于基因工程育种及分子育种领域，具体涉及一组snp标记、玉米 zmer1基因及其在提供玉米抗穗腐病抗性中的应用。

背景技术：

1、玉米是世界第一大粮食作物，穗腐病（ear rot）是全球玉米主产区普遍发生的真菌侵染性病害。玉米穗腐病又称玉米穗粒腐病（kernel and ear rot），是世界范围内玉米产区普遍发生的一类真菌侵染性病害，主要致病菌包括拟轮枝镰孢菌（ fusarium  verticillioides, fv）、禾谷镰孢菌（ f. graminearum, fg）以及黄曲霉菌（ aspergillusflavus, af）等，相应穗腐病类型分别为 fusarium ear rot（fer）、 graminearumear rot（ger）以及 aspergillusear rot（aer），其中拟轮枝镰孢菌在世界范围内流行范围最广（logrieco et al. 2002）。大多数病原真菌可分泌真菌毒素，如fv、fg、af分别可分泌伏马毒素、玉米烯酮和黄曲霉毒素等。穗腐病的发生一方面会造成玉米减产,严重威胁全球粮食安全；另一方面穗腐病分泌的真菌毒素会使人类和牲畜器官发生病变，甚至诱发癌症而致死（yang et al. 2020）。据统计，全球玉米生产每年因穗腐病造成的经济损失可达数十亿美元（wu et al. 2012）。此外，当前玉米穗腐病的防治主要以化控为主，化学药剂的大量使用增加了环境污染，也导致碳排放增加（chen et al. 2009）。

2、调控真菌侵染和真菌毒素积累的遗传机制可能存在较大差异，如maschietto等（2017）利用相同遗传群体分别检测到 15个调控fer 的位点和17个调控伏马毒素积累的位点，只有8个位点是二者共有的，表明二者遗传调控基因及调控机制存在显著不同。目前克隆的调控玉米穗腐病抗性基因较少，其中转录因子编码基因还未见报道。

3、类黄酮物质包含多种化合物，其合成和代谢涉及较多物质合成相关基因和调节基因，已有报道多种类黄酮可调节植物生长发育及与微生物的互作等过程（dong and lin,2021; wang et al. 2022）。如类黄酮中橘皮素在水稻中可通过抑制真菌铁死亡从而调控稻瘟病抗病（liang et al. 2021），类黄酮中希诺宁则证明在体外条件下对fv和fg生长具有抑制作用（förster et al. 2022）。在低剂量条件下，芹菜素、木犀草素和槲皮素三种类黄酮物质对af生长和黄曲霉毒素积累具有抑制作用（köllner, 2022）。eqtl（expressedquantitative trait loci）分析则证明黄酮类生物合成途径基因与玉米籽粒af感染具有显著相关性（castano-duque et al. 2022）。利用籽粒颜色差异遗传材料，证明类黄酮色素特别是鞣红具有显著抑制伏马菌素的作用（pilu et al. 2011）。同样利用籽粒颜色差异遗传材料，发现鞣红可以调控玉米籽粒果皮厚度，并抑制伏马菌素的积累（landoni et al.2020）。

4、在玉米中，类黄酮生物合成受到编码r2r3 myb转录因子的 zmp1（ pericarp  color1）基因调控（grotewold等，1994；coe et al. 1988）。 zmp1存在多个等位基因，其等位变异影响玉米果穗色素沉积模式（brinks&styles, 1966; cocciolone et al. 2001），其中对 p1-rr（红色果皮/红色穗轴）、 p1-wr（白色果皮/红色穗轴）、 p1-rw（红色果皮/白色穗轴）和 p1-ww（白色果皮/白色穗轴）等位基因研究较多。比较 zmp1等位位点发现 zmp1存在丰富拷贝数变异，如 p1-rr具有 zm p1单基因拷贝，而 p1-wr则由 zmp1六个拷贝串联重复构成，基因表达差异则主要由 p1-wr相对于 p1-rr的dna高甲基化造成（chopra et al. 1998）。

5、综上所述，前人研究结果表明类黄酮物质含量和真菌毒素积累存在一定联系，但是 zmp1能否直接调控玉米穗腐病抗性还不清楚，尚待进一步研究。

6、本发明利用crispr/cas9（clustered, regularly interspaced, shortpalindromic repeats-associated endonuclease 9）基因编辑技术创制了两种不同突变类型的 zmer1基因敲除突变体 zmer1-1及 zmer1-2。本发明通过人工接种拟轮枝镰孢菌处理野生型和 zmer1突变体，对其穗腐病发病面积分析发现 zmer1基因缺失会导致植株对拟轮枝镰孢菌侵染更加敏感，即玉米 zmer1基因在增强玉米穗腐病抗性能力中发挥重要作用。序列对比发现， zmer1基因与 zmp1基因核苷酸序列高度一致。本发明为玉米抗穗腐病相关基因的挖掘及玉米抗穗腐病新品种的培育提供了新的基因资源。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供玉米抗穗腐病新snp标记snp1-50和新基因 zmer1及其在调控玉米穗腐病抗性中的应用。snp1-50在玉米的第1号染色体的位置如表1所示， zmer1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示， zmer1基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示， zmer1正调控玉米穗腐病抗性。

2、在玉米中利用snp即snp1-50可以通过分子标记辅助选择或全基因组选择出抗穗腐病玉米。

3、在玉米中敲除 zmer1基因会导致玉米对穗腐病胁迫敏感，抗穗腐病能力下降。

4、在 zmer1基因第3个外显子处设计crispr/cas9载体靶点（mt1和mt2)，所述靶点的dna序列如seq id no.3和seq id no.4所示；最终获得两种不同编辑类型的突变体 zmer1-1和 zmer1-2，均表现出穗腐病敏感表型。

5、本发明的目的在于研究 zmer1在玉米穗腐病胁迫中的应用，为抗穗腐病玉米的培育提供新的种质资源。具体技术方案如下：

6、1、抗穗腐病遗传位点鉴定，所述鉴定方法为全基因组关联分析，所利用群体为由ss、nss、pa、pb、tspt亚群材料所组成的1223份玉米自交系。全基因组关联分析所用模型为emmax (efficient mixed-model association expedited)，所取阈值为<1e-10。

7、2、玉米b73 zmer1基因的序列分析，所述 zmer1基因编码的核苷酸序列如seq idno:1所示，所述 zmer1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2中所示。选择合适位点进行基因编辑靶点设计。

8、3、构建基因编辑载体，利用农杆菌介导法将基因编辑载体导入玉米自交系x249的愈伤组织中，获得t1代阳性植株后，以人接种拟轮枝镰孢菌至果穗的方法考察其抗穗腐病能力的变化。

9、本发明利用全基因组关联分析方法鉴定出与玉米穗腐病抗性显著关联的snp标记，利用crispr/cas9技术对玉米 zmer1基因第3个外显子进行定点基因编辑，获得了该基因的2种不同编辑类型的突变体，这两种突变体均表现出穗腐病敏感表型，推测 zmer1基因正调控玉米的穗腐病抗性。结果不仅揭示了 zmer1在玉米穗腐病胁迫中的功能，也为抗穗腐病玉米培育提供新的分子标记和基因资源。

10、基于此，本发明鉴定到一组与玉米穗腐病抗性显著关联的snp组合，一个新的与玉米穗腐病抗性相关的 zmer1基因，利用目前基因编辑中应用广泛的crispr/cas9技术，创制玉米 zmer1基因的突变体，并评估其抗穗腐病胁迫的能力，为抗穗腐病玉米的培育提供新的分子标记和基因资源。