产苹果酸的季也蒙毕赤酵母重组菌及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程和生物，具体涉及一株产苹果酸的季也蒙毕赤酵母重组菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、苹果酸，又名2－羟基丁二酸，由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。大自然中，以三种形式存在，即d-苹果酸、l-苹果酸和其混合物dl-苹果酸。其为白色结晶体或结晶状粉末，有较强的吸湿性，易溶于水、乙醇，有特殊愉快的酸味。苹果酸在人体代谢中有重要作用，能够有效的提高运动能力、抗疲劳等；同时，l-苹果酸有较强的去污能力，在牙膏、洗面奶等日化品中均可添加；所以l-苹果酸在食品、药品、保健品以及化工行业都有着广泛的应用，其中产量每年约为4万吨，而世界市场潜在需求量达到每年6万吨。

2、苹果酸主要用于食品和医药行业。目前，苹果酸主要是通过化学合成工艺生产的。然而，由于化学过程可能产生有毒和不可降解/可回收的副产品，人们越来越关注化学过程的安全性和可持续性。此外，只有l-苹果酸盐可用于食品和药品，但化学合成过程产生d-和l-苹果酸盐的混合物，这不适用于食品和药品。相反，由于微生物生产的不是d-苹果酸，而是l-苹果酸，因此以发酵为基础的生产工艺可能更具吸引力。但是，微生物发酵的主要野生菌株是霉菌，但是其存在发酵产物中可能会掺杂霉菌毒素，发酵周期较长，菌丝和菌球在发酵期间不可控等问题。同时霉菌发酵过程中需要加入大量中和剂，增加了生产成本与下游分离产物的难度。因此，开发安全耐酸的工程酵母是实现l-苹果酸高效合成的关键。此外，季也蒙毕赤酵母能天然利用甲醇为碳源，这为苹果酸的生物合成降低生产成本，同时能够实现低劣生物质资源的高价值转化。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一株产苹果酸的季也蒙毕赤酵母重组菌。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用如下方案：

3、一株产苹果酸的季也蒙毕赤酵母重组菌，所述重组菌通过在宿主菌中表达来源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 ropyc、苹果酸脱氢酶基因 romdh和/或来源于粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白基因 spmae得到；

4、其中，所述宿主菌为季也蒙毕赤酵母基因改造菌株 gsh-slc-e-ea20。

5、作为一种优选的实施方式，所述 ropyc基因、 romdh基因之间通过插入linker进行融合表达。

6、作为一种优选的实施方式，所述linker的氨基酸序列为gggggggg、gggekggg、gggsgggs或ggggsggpgs；优选gggsgggs。

7、作为一种优选的实施方式，所述 ropyc、 romdh和 spmae的核苷酸序列分别如seq idno：1-3所示。

8、本发明的第二目的在于提供上述重组菌的构建方法，包括：

9、构建 ropyc、 romdh和/或 spmae的共表达质粒，将所述共表达质粒线性化后，通过酵母转化试剂盒导入宿主菌，获得所述重组菌。

10、作为一种优选的实施方式，用于表达 ropyc、 romdh和 spmae基因的载体质粒为113-gpd-tef质粒。

11、本发明的第三目的在于提供上述重组菌在发酵生产苹果酸中的应用。

12、作为一种优选的实施方式，将所述重组菌进行种子培养、发酵培养，合成苹果酸。

13、作为一种优选的实施方式，重组菌发酵温度为18-37℃；优选30-33℃。

14、作为一种优选的实施方式，所述重组菌发酵培养的培养基中不含中和剂。

15、本发明具有如下有益效果：

16、（1）本发明利用季也蒙毕赤酵母生产苹果酸，相比酿酒酵母，季也蒙毕赤酵母对具有低糖基化修饰的蛋白质具有较高的分泌能力。此外，季也蒙毕赤酵母也是一种相对罕见的酵母菌中，可以利用烷烃为唯一碳源和能量来源，同时也能够利用甲醇为碳源，使得未来有望使用甲醇或其他低劣质碳源替代葡萄糖实现苹果酸的生产，从而实现利用低劣生物质资源实现产物的高价值转化。

17、（2）本发明利用一株抗逆性良好的季也蒙毕赤酵母 gsh-slc-e-ea20整合来源于米根霉 ropyc和 romdh以及来源粟酒裂殖酵母的 spmae基因得到的重组菌株r2-s，成功合成了6.42 g/l的l-苹果酸。此外，本申请在ropyc和romdh基因之间导入不同的linker：gggggggg，ekgggek，gggekggg，gggsgggs和ggggsggpgs进行融合蛋白表达，其中，导入linker-gggsgggs的l-苹果酸产量为10.74 g/l，产量增加了90.76%。

18、（3）本发明构建的重组菌可在发酵体系不添加任何ph调节剂的条件下实现苹果酸的高效生产。此外，本发明首次在产苹果酸的季也蒙毕赤酵母中引入linker将苹果酸合成关键基因进行融合表达，有效减少了底物与产物之间的距离，有利于底物的快速转化，实现了蛋白功能的强化，进一步提高了低ph下苹果酸的产量，为其他微生物发酵提供参考。

1.一株产苹果酸的季也蒙毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述重组菌通过在宿主菌中表达来源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因ropyc、苹果酸脱氢酶基因romdh和/或来源于粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白基因spmae得到；

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述ropyc基因、romdh基因之间通过插入linker进行融合表达。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述linker的氨基酸序列为gggggggg、gggekggg、gggsgggs或ggggsggpgs；优选gggsgggs。

4. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述ropyc、romdh和spmae的核苷酸序列分别如seq id no：1-3所示。

5.权利要求1-4任一项所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，用于表达ropyc、romdh和spmae基因的载体质粒为113-gpd-tef质粒。

7.权利要求1-4任一项所述重组菌在发酵生产苹果酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述重组菌进行种子培养、发酵培养，合成苹果酸。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，重组菌发酵温度为18-37℃；优选30-33℃。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组菌发酵培养的培养基中不含中和剂。