可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统及方法

本发明涉及可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统及方法。

背景技术：

1、目前，鹿茸干细胞外泌体多采用二维细胞培养方法获得，这种方法需要大规模培养细胞获得的大体积的细胞培养液，限制外泌体产业化应用。虽然目前有三维培养体系的应用，其采用固定在容器中的中空纤维培养，产量和效率相比于二维细胞培养方法有所提高，但仍不能实现高效量产以及同时培养多种细胞。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统及方法，显著提高了外泌体产量，可同时培养多种细胞，更加灵活方便。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统，包括储液瓶、循环泵、若干个并联的培养筒和连接每个所述培养筒的收集器，所述储液瓶通过进管道和出管道分别连接若干培养筒的并联进口端和并联出口端，所述循环泵设置在所述出管道上；所述培养筒的左右两侧分别设置一个收集器；所述收集器与每个所述培养筒通过分支管连通，在所述分支管上设置阀门；所述储液瓶内的培养液通过所述循环泵进入所述培养筒后再经出管道回流到储液瓶；所述培养筒内设置多层中空纤维层，相邻中空纤维层之间留有间隙。

4、进一步的，在每个所述储液瓶的进管道和出管道上分别设置一个阀门。

5、进一步的，所述收集器为手动或电动吸取装置。

6、进一步的，所述储液瓶中包含dmem培养基、10％血清、双抗和因子。

7、本发明还提供一种使用如上述可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统的培养方法，包括如下步骤：

8、第一步，培养系统预处理后接种细胞；

9、第二步，低糖收获；

10、接种的细胞稳定下来之后，在培养筒的细胞量未达满载时，即葡萄糖消耗量<1g/天时,可随时收获细胞上清，收获步骤如下：

11、b1、培养筒左侧的收集器为空，右侧的收集器盛有10-15ml新鲜培养基；

12、b2、关闭需要采集的培养筒的并联进口端和并联出口端，开启需要采集的培养筒的两个分支管的阀门；

13、b3、用培养筒左侧的收集器收获10-15ml的细胞上清；

14、b4、再用右侧的收集器打入与b3步骤中收获的等体积的培养基；

15、b5、关闭培养筒两个分支管的阀门，开启培养筒的并联进口端和并联出口端，通过循环泵开启培养液循环培养；

16、第三步，高糖收获；

17、在培养筒的细胞量达到满载时，即葡萄糖消耗量>1g/天时,取出过多的细胞，该步骤收获的部分细胞产物在离心去掉细胞后收集，具体获步骤如下：

18、c1、培养筒两侧的收集器均为空；

19、c2、关闭需要采集的培养筒的并联出口端，松开储液瓶口让管路内气压平衡；

20、c3、开启培养筒左侧分支管的阀门，用左侧的收集器吸取约5ml溶液；

21、此时液体从储液瓶通过并联进口端进入培养筒，液体会穿过培养筒内的纤维层，将附着于纤维上的细胞顶离纤维，使更多细胞脱落；

22、c4、关闭培养筒左侧分支管的阀门，开启培养筒右侧分支管的阀门，用右侧的收集器吸取约5ml溶液；

23、c5、关闭并联进口端及储液瓶口，开启培养筒左侧分支管的阀门；

24、c6、用2个收集器来回冲打约3-5次，使更多的细胞从纤维上冲落；

25、c7、把收获溶液集中于左侧的收集器后，取下收集器；

26、c8、关闭培养筒两侧分支管的阀门，开启并联出口端和并联进口端的阀门，通过循环泵开启培养液循环培养。

27、第一步中培养系统预处理方法如下：

28、a1、先以pbs溶液循环24-48小时；

29、a2、接着换成基础培养基循环24-48小时；

30、a3、再换成完全培养基循环24-48小时；

31、a4、最后换上新鲜的完全培养基，接种细胞。

32、本发明的有益效果是：改进和优化了干细胞中空纤维三维培养体系，设计了超大型并联培养桶，改进优化后的培养体系单位时间处理细胞数量由1ⅹ1011提升至4ⅹ1011，单次鹿茸干细胞外泌体收获量从3.3ⅹ1012个提升至1.3ⅹ1013个，可连续稳定收集60次以上，4ⅹ1011个细胞总计收获7.8ⅹ1014个鹿茸干细胞外泌体，一个治疗周期注射7次外泌体(108/次)，可满足106个治疗周期的需要。本发明显著提高了外泌体产量，可同时培养多种细胞，更加灵活方便。

1.可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统，其特征在于：包括储液瓶、循环泵、若干个并联的培养筒和连接每个所述培养筒的收集器，所述储液瓶通过进管道和出管道分别连接若干培养筒的并联进口端和并联出口端，所述循环泵设置在所述出管道上；所述培养筒的左右两侧分别设置一个收集器；所述收集器与每个所述培养筒通过分支管连通，在所述分支管上设置阀门；所述储液瓶内的培养液通过所述循环泵进入所述培养筒后再经出管道回流到储液瓶；所述培养筒内设置多层中空纤维层，相邻中空纤维层之间留有间隙。

2.如权利要求1所述的可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统，其特征在于，在每个所述储液瓶的进管道和出管道上分别设置一个阀门。

3.如权利要求1所述的可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统，其特征在于，所述收集器为手动或电动吸取装置。

4.如权利要求1所述的可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统，其特征在于，所述储液瓶中包含dmem培养基、10％血清、双抗和因子。

5.使用如权利要求1-4中任一项可产业化的鹿茸干细胞外泌体三维培养系统的培养方法，包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，第一步中培养系统预处理方法如下：