一种带有GUS标记大丽轮枝菌的构建方法和应用

本发明属于生物防治，尤其涉及一种带有gus标记大丽轮枝菌的构建方法和应用。

背景技术：

1、大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是一种严重的土传维管束病害，严重危害棉花生产，有棉花“癌症”之称。化学防治对环境不友好，套作轮作可行性不高，现有抗性品种持久性差，究其原因是病原菌侵染过程和致病机理不清楚。由于大丽轮枝菌菌丝体接近透明，无法直接观察其侵染过程。目前，较为常见的是应用绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein，gfp)标记大丽轮枝菌观察其侵染棉花过程，可指示病原菌在侧根表面和表皮等部分侵染情况，无法实时观测大丽轮枝菌在整个侵染过程的定殖和消涨动态，尤其是木质部自发荧光信号强，极大干扰了gfp的指示功能。

2、鉴于β-glucuronidase(gus)标记的菌株稳定性好和方便观察的优势，通过切片观察可实现不同侵染时间、不同组织部位实时监测菌株侵染寄主的动态过程。目前，还未见有关gus标记大丽轮枝菌的报道，本发明提供一种在大丽轮枝菌中稳定高效表达gus蛋白的技术，gus标记的大丽轮枝菌在侵染过程解析和侵染机理研究中应用广泛，为深入阐明寄主和病原菌互作机理提供技术支撑。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种大丽轮枝菌gus基因标记的技术，在大丽轮枝菌侵染机理的研究中加以应用。

2、本发明是这样实现的：将gus基因序列克隆到用于大丽轮枝菌农杆菌转化的双元载体的t-dna片段区间，通过农杆菌转化使gus基因表达盒整合到大丽轮枝菌基因组上，使大丽轮枝菌突变体带上gus基因标记，方便后续侵染机理的研究。

3、本发明提供了一种大丽轮枝菌gus标记菌株的构建方法，包括以下步骤：

4、(1)对大肠杆菌来源的gus基因序列进行优化，使之适应大丽轮枝菌基因组密码子的使用频率；

5、(2)克隆优化后的gus基因序列到大丽轮枝菌过表达载体pcambia1303-hpt中，并确保gus基因由gpda启动子驱动，nos终止子终止；

6、(3)通过农杆菌介导的转化(agrobacterium tumefaciens mediatedtransformation，atmt)将上述载体转化到大丽轮枝菌中，从而获得带有gus标记的大丽轮枝菌菌株。

7、其中所述gus基因序列优化后的具体序列如序列表所示。筛选出gus基因稳定表达的菌株，所述菌株为大丽轮枝菌(verticillium dahliae)vd991-gus-23-13，该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2024年5月21日，保藏编号为cctcc no： m 20241027。

8、本发明的另一目的在于提供一种带gus标记的大丽轮枝菌突变体菌株构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

9、(1)构建中间载体pgko2-gateway(sk1861)-gus，通过将经优化的gus表达盒与hpt表达盒序列融合并替换载体pgko2-gateway(sk1861)中的attp1-attp2之间的特定序列；

10、(2)克隆目的基因编码区上下游约1000bp序列到gus表达盒与hpt表达盒序列的两端，组成最终的目的基因敲除载体；

11、(3)通过atmt，将目的基因敲除载体转化大丽轮枝菌，筛选出带有gus标记的大丽轮枝菌目的基因敲除突变体。

12、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

13、第一，针对上述现有技术存在的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

14、(1)大肠杆菌来源的gus基因在大丽轮枝菌里面的表达受到限制，我们根据大丽轮枝菌基因组密码子使用频率，对gus基因进行密码子的优化，优化后的gus基因在大丽轮枝菌里成功表达，序列见序列表。

15、(2)使用真菌组成型表达启动子gpda来驱动gus基因表达，使得gus基因表达量稳定并且转化子菌丝经过gus染色后显色清晰，利于侵染棉花后观察菌丝侵染的动态过程。

16、第二，本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

17、在以往大丽轮枝菌侵染过程的相关研究中，一般采用gfp标记的大丽轮枝菌来观察侵染过程，但由于gfp菌株不能全过程全部位观察其侵染过程，导致大丽轮枝菌侵染过程至今尚未清楚解析。

18、本发明通过对大丽轮枝菌进行gus基因标记，在菌株侵染棉花后不同时间点取样进行gus染色，切片、染色、显微观察菌株的侵染过程，从而弥补了相关研究领域的空白。

19、第三，本发明提供的两个实施例在基因工程和植物病理学领域带来的显著技术进步主要包括：

20、(1)精准的基因功能研究：通过gus标记技术，可以精准地追踪大丽轮枝菌在植物体内的定殖分布和侵染规律，为深入理解其与宿主相互作用的机理提供了强有力的工具。

21、(2)促进病原机理研究：利用带有gus标记的大丽轮枝菌菌株进行实验，可以直观地观察到菌株在宿主植物体内的侵染过程，从而更深入地理解病原菌的侵染机制和宿主的防御反应。

22、(3)目的基因的功能验证：通过目的基因敲除菌株的构建和应用，能够验证病原菌特定基因在病原菌侵染过程中的具体作用，为开发新的病害防治策略提供了理论基础。

23、(4)加强病害防治研究：这些技术的应用有助于开发更有效的病害管理策略，包括新型的抗病品种培育和生物防治方法。

24、(5)推动植物病理学研究的发展：这些新的技术和方法为植物病理学领域带来了新的研究手段，促进了该领域的科学研究和实际应用的发展。

25、总的来说，这两个实施例通过将先进的分子生物学技术应用于植物病原菌的研究，为更加全面和深入地理解病原菌的生物学特性和与宿主植物的相互作用提供了新的视角和方法。

1.一种gus标记的大丽轮枝菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述gus基因序列优化后的具体序列如序列表所示。

3.一种gus标记的大丽轮枝菌突变体菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：