一种高效获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化工艺的制作方法

本发明属于利用基因工程技术制备人血清白蛋白的生物，具体来说是一种高效获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化工艺。

背景技术：

1、分子生物学技术的发展为利用生物反应器生产外源蛋白提供了许多方法和手段。到目前为止，已发展出了大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种外源蛋白表达系统。巴斯德毕赤酵母(pichia.pastoris)基因表达系统经过近三十年发展，已成为目前表达外源蛋白的最重要宿主之一，如宿主菌gs115(cregg，et al(2009).methods enzymol.463，169–189；us patent4，879，231，phillips petroleum，1989)。该系统具有易于高密度发酵，目的基因稳定整合在宿主基因组，能使表达产物有效分泌并适度糖基化，培养基价廉经济等特点。该基因表达系统利用了高效可调控启动子aox1，已高效表达了hbsag、tnf、egf、破伤风毒素c片段、基因工程抗体等数千种外源蛋白，证实该系统为高效、实用、简便，以及提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜于中试放大并扩大为工业化规模生产。

2、利用毕赤酵母表达外源基因一般包括以下步骤:①将外源基因插入毕赤酵母重组表达载体；②用内切酶处理线性化的重组质粒，再转化毕赤酵母菌株；③将转化液涂布在md平板上进行阳性重组子的首轮筛选；④用内含g418不同浓度梯度的ypd平板进行阳性重组子的第2轮筛选；⑤进一步鉴定外源基因在酵母基因组中的整合情况；⑥小规模诱导表达鉴定外源基因的表达水平；⑦利用生物反应器进行大规模发酵生产及从发酵液内制备重组蛋白。为了提高外源基因在毕赤酵母中的表达量，通常需要筛选含高拷贝数外源基因的毕赤酵母转化子，即提高宿主菌内的基因剂量；而高拷贝数转化子的筛选是通过逐步提高g418抗性来完成的，这项工作本身非常繁杂而又随机；进一步考察高拷贝毕赤酵母转化子和高表达外源蛋白之间还是存在很多变数，因目的基因的不同呈现不同的最适拷贝数，两者之间并不存在线性关系。在毕赤酵母常用的系列重组表达载体pic9k，pic3.5k等，引入了g418抗性基因。转化宿主菌后，外源基因和抗性基因一起以同源重组的方式同时整合到毕赤酵母染色体上。通过提高g418的抗性筛选，可以筛选到转化子群体中占小概率的多拷贝数插入的内含目的基因的转化子。

3、为了筛选到高拷贝数的阳性克隆，需要用不同浓度梯度的g418平板进行筛选，预实验的g418浓度梯度设定为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0mg/ml。据invitrogen公司推荐的protocol上介绍了筛选方案。第一种方法是制备不同浓度梯度的g418平板，用影印的方法将his4营养缺陷平板上的阳性克隆逐一影印到g418梯度平板上进行高拷贝数克隆的筛选。这种方法的特点是工作量巨大(在影印之前还需连续转接培养3次，以保证影印时每个单转化子的浓度相当)，筛选难度高，周期长，而且筛选的转化子数相对较少，不能做高通量筛选。第二种方法同样需要制备不同浓度梯度的g418平板，不同的是可以用无菌水或液体培养基将his4营养缺陷平板上生长出来的全部阳性转化子洗下来，再将其稀释至合适的浓度，取一定量稀释液体分别涂到内含g418不同浓度梯度平板上，这种方法的操作相对简易，能筛选到的转化子较多。但针对含不同的目的基因或不同毕赤酵母宿主菌，需要预先做预实验来探索菌液稀释度的试验。这两种筛选方案是目前国内外科技工作者利用毕赤酵母表达系统表达外源蛋白时使用的通用筛选方法。但是它们共同的缺点就是g418的用量大，操作繁琐，工作量大，费时费力，不同毕赤酵母宿主菌的筛选方法的通用性较差。

技术实现思路

1、1.发明要解决的技术问题

2、本发明的目的在于解决现有的基因重组人血清白蛋白制备产物存在基因表达水平低、发酵过程控制工艺不成熟(由于发酵规模大，往往需要十吨或几十吨大型发酵罐，而大罐的过程控制与检测手段缺乏先例和工具)，及重组人血清白蛋白的纯化工艺不成熟(由于重组人血清白蛋白是特例，目的蛋白的纯化规模及设备特别大型化，而目的蛋白的纯度要求特别高，纯度要求达到99.99％以上)，即纯化步骤多达十几步，纯化介质载量低，纯化效率低及纯化回收率低等问题。

3、2.技术方案

4、为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

5、本发明的一种高效获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化工艺，所述纯化工艺包括如下步骤：

6、s310、取出发酵液；

7、s320、发酵液离心；

8、s330、上清液膜过滤；

9、s340、热处理；

10、s350、二次膜过滤；

11、s360、层析；

12、所述步骤s310的发酵液为将新型宿主菌接种在培养基上进行发酵获得的发酵液，所述新型宿主菌为巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)hsa-c16，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.30175，保藏日期为2024年03月28日。

13、优选地，所述新型宿主菌为通过将重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)cbs7435菌株而得到的表达基因重组hsa的工程菌，所述重组表达载体的核苷酸序列如seq id no：1所示。

14、优选地，所述重组表达载体包含：

15、(1)一种巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区，内含启动子元件，这种5’调控区选自毕赤酵母来源的醇氧化酶aox1基因、二羟基丙酮合成酶das1基因或组氨醇脱氢酶his4基因，调控区的3’末端与下述(2)的序列相连接；

16、(2)一种编码人血清白蛋白的优化基因，其中包含的核苷酸序列如seq id no:2所示，其中包含的氨基酸序列如seq id no:3所示；

17、(3)一种甲醇酵母来源的3'终止序列，这种3'终止序列选自巴斯德毕赤酵母来源的aox1基因、aox2基因或his4基因的3’终止序列。

18、优选地，还包括

19、至少一种可供在大肠杆菌中筛选的标记基因；

20、一种在大肠杆菌宿主菌内能复制的复制起点的dna片段；

21、还包含至少二种可供在酵母中筛选的标记基因。

22、优选地，所述重组表达载体为ppic9、ppic3、ppiczαabc、ppic3.5k、phil-s1、phil-d2、pa0804、pa0815、pgapzαabc、ppic6αabc、ppic9k中的任意一种通过限制性内切酶saci或bglⅱ酶切后的线性化载体。

23、优选地，所述重组表达载体为hsa-ppic9k通过限制性内切酶saci或bglⅱ酶切后的线性化载体，其中至少含有一个拷贝的优化设计的编码人血清白蛋白的优化基因。

24、优选地，所述编码人血清白蛋白的优化基因中，选用巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(aox1)基因偏爱的偏爱密码子并控制该基因偏爱密码子占编码的优化基因密码子总数的90％。

25、优选地，所述编码人血清白蛋白的优化基因中，在优化基因内部从5’至3’方向依次插入了sali、hind iii、xba i三个限制性内切酶位点，使优化基因相对均衡地被分割成四个大片段。

26、优选地，所述编码人血清白蛋白的优化基因中，减少连续的g-c配对，增加毕赤酵母偏爱的a-t配对，使优化基因内部的gc含量调整至45～50％。

27、优选地，所述编码人血清白蛋白的优化基因中，还包括表达阅读框架为

28、将5’端的限制性内切酶bamhi位点插入到aox1基因5’调控区域(启动子区域)，后接ccaaacgatg 10个脱氧寡聚核苷酸(内含真核基因的kozak序列，即axxatg)，再接酿酒酵母来源的酵母a-交配子引导肽(85个氨基酸组成)序列，再在ppic9k重组表达载体的多克隆位点的ecori和noti之间插入hsa成熟基因；

29、在目的基因5’端的ecori酶切位点后面插入了赖氨酸和精氨酸两个双碱性氨基酸(-lys-arg-)的编码序列aaaaga，具体序列为seq id no:4；在目的基因3’端的noti酶切位点之前插入了双重终止密码子taatag，具体序列为seq id no:5。

30、优选地，所述步骤s310中的发酵液通过如下步骤制备得到

31、s210、配置培养基；

32、s220、电极标定；

33、s230、投料；

34、s240、接种，将高表达人血清白蛋白的新型宿主菌进行接种；

35、s250、发酵；

36、s260、放罐。

37、优选地，所述步骤s210的培养基包括如下组分：h3po4、caso4·2h2o、k2so4、mgso4·7h2o、koh、、生物素、氨水、98％glycerol或100％甲醇，及消泡剂。

38、优选地，所述h3po4的含量为26.7ml/l，所述caso4·2h2o的含量为0.47g/l，所述k2so4的含量为9.1g/l，所述mgso4·7h2o的含量为7.5g/l，所述koh的含量为4.13g/l，所述98％glycerol的含量为40g/l，所述甲醇在罐内发酵液里的浓度控制在0.2-0.9％，所述消泡剂的含量为0.5ml/l。

39、优选地，所述步骤s200中的电极标定具体为对发酵罐进行ph电极标定和溶氧电极标定。

40、优选地，所述步骤s230投料具体为将步骤s210制备的培养基混合液投入后，进行高温灭火冷却备用。

41、优选地，所述步骤s250的发酵包括基础培养阶段、过渡培养阶段和诱导表达阶段。

42、优选地，所述基础培养阶段具体为

43、工程菌发酵开始，启动scada过程控制软件进行数据记录，发酵时间记录和批号记录，开启图谱记录；从接种子菌入发酵罐起，每4小时定时记录相关发酵数据；控制参数设置如下：用氨水将ph控制在5.5±0.1，温度控制在28±1℃；控制do值在30以上，空气流量为2vvm，罐压控制在0.03～0.04mpa；do反弹后，进入过渡培养相阶段；反弹时取样检测od600应在50左右。

44、优选地，所述过渡培养阶段具体为

45、过渡培养阶段待do反弹后，立即流加50％甘油，在加50％甘油中加入含生物素的ptm1溶液12ml/l，同时将搅拌调节至发酵罐规定的最高转速、空气流量调节为2vvm，罐压调节至0.04～0.08mpa；在此条件下，补料速度控制do值在30±10；每隔1小时至少进行一次do-spike，确保do-spike响应时间在60秒以下；流加周期约为4～5小时；流加甘油时，每隔1小时平均调整ph设定值，使之在甘油补料结束后ph为项目要求的诱导ph值为5.7；控制过渡培养阶段结束时，od600≈100。

46、优选地，所述诱导表达阶段具体为

47、甘油停止补加后，观察到溶氧do反弹后，补加甲醇4g/l并在甲醇中添加12ml/l的ptm1；加入待加入的甲醇耗完后(do反弹)，以do-spike方式开始流加甲醇，do-spike响应时间在60秒以下，将do值控制在10-30；开始流加甲醇同时，将温度调至24℃；控制ph在项目指定ph5.7；并每隔12小时做一次do-spike，并记录响应时间和其他发酵数据；每隔12小时取样一次，检测ph和工程菌湿重，离心，取上清液100μl加入电泳buffer，100℃煮沸5分钟后，放入-20℃保存；其他剩余上清液于2～8℃冰箱保藏，待检测或电泳分析；取样时做好样品标记；在诱导表达阶段，维持罐内发酵液里的甲醇浓度控制在0.2-0.9％之间。

48、3.有益效果

49、采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：

50、本发明的一种高效获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化工艺，所述纯化工艺包括如下步骤：s310、取出发酵液；s320、发酵液离心；s330、上清液膜过滤；s340、热处理；s350、二次膜过滤；s360、层析；所述步骤s310的发酵液为将新型宿主菌接种在培养基上进行发酵获得的发酵液，所述新型宿主菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.30175，保藏日期为2024年03月28日。通过目的基因的优化设计、构建含高拷贝数外源基因及高表达水平的毕赤酵母工程菌及中试发酵工艺的优化等，使基因重组人血清白蛋白的表达水平达到25.82g/l的超高水平；重组人血清白蛋白的纯化工艺仅使用发酵液预处理和三步柱层析，目的蛋白纯度已达到99％以上，整个纯化工艺的回收率达到60％以上。

51、生物保藏说明巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)hsa-c16，于2024年03月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.30175。