含黄素单加氧酶基因、产物及其在蒜氨酸合成中的应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及含黄素单加氧酶基因、产物及其在蒜氨酸合成中的应用。

背景技术：

1、大蒜(allium sativum l.)是一种重要的蔬菜、调味品和药用植物。蒜氨酸是自然界中仅存于大蒜中的含硫氨基酸，同时也是大蒜中主要生物活性物质之一。大蒜作为重要的鳞茎类蔬菜之一，具有辛辣刺鼻的味道，是一种常见的香料和食品添加剂。含硫化合物，如大蒜素及其代谢产物，是大蒜辛辣效果和辛辣气味主要原因。传统上，大蒜及其相关化合物被认为具有多种生物活性，包括抗癌、抗氧化剂、抗糖尿病、肾脏保护、抗真菌和抗高血压活性。此外，大蒜还被用于传统医学中，用于治疗消化不良、呼吸道和尿路感染以及心脏疾病，它具有驱虫、解热、镇静和利尿的作用。虽然蒜氨酸有独特的营养和药用价值，但至今关于蒜氨酸生物合成的分子调控途径仍不明确，因此研究蒜氨酸生物合成分子调控机制至关重要。

2、s-烯丙基半胱氨酸被大蒜提取物立体特异性氧化为(+)-s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜，表明在大蒜中存在能催化(+)-s-烯丙基-l-半胱氨酸亚砜合成的氧化酶。在文章“identification of a flavin-containing s-oxygenating monooxygenase involvedin alliin biosynthesis in garlic”中，yoshimoto等人首次基于est在fukuchi-howaito(日本北海道的大蒜品种)中发现一个编码含黄素单加氧酶(flavin-containingmonooxygenase，fmo)的基因，将其命名为asfmo1(ncbi no.ab924383.1)，通过酵母异源表达表明asfmo1在体外参与蒜氨酸合成。asfmo1与b类黄素单加氧酶一致，具有nadp、fad和fmo保守基序，其催化的s-氧化反应依赖于nadph和fad的存在。asfmo1作为s-烯丙基-l-半胱氨酸-s-加氧酶(s-allyl-l-cysteine-s-oxygenase)起作用，可能在发芽期间将储存的γ-谷氨酰-s-烯丙基-l-半胱氨酸转化为蒜氨酸或在叶片中从头合成蒜氨酸，但尚未发现asfmo1调控大蒜蒜氨酸生物合成过程的功能报道，其分子调控机理及应用仍不明确。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供含黄素单加氧酶基因、产物及其在蒜氨酸合成中的应用。本发明针对现有技术的进展，结合长期研究和探索，从“金乡四六瓣”中筛选了多个蒜氨酸生物合成中的含黄素单加氧酶基因asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5(seq id no.1～5)，并从中鉴定出两个特别优异的基因asfmo1和asfmo2(seq idno.1～2)。本研究进一步揭示了大蒜蒜氨酸生物合成基因，并利用大蒜遗传转化方法获得高蒜氨酸含量和低含量蒜氨酸的转基因大蒜，为大蒜分子育种工作做出了贡献，具有实际应用价值。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供含黄素单加氧酶基因，所述含黄素单加氧酶基因的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.5任一项所示。

4、本发明的第二方面，提供所述含黄素单加氧酶基因在调控大蒜蒜氨酸合成中的应用。

5、本发明的第三方面，提供含黄素单加氧酶基因编码的蛋白，所述含黄素单加氧酶基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.50～seq id no.54任一项所示。

6、本发明的第四方面，提供所述含黄素单加氧酶基因编码的蛋白在调控大蒜蒜氨酸合成中的应用。

7、本发明的第五方面，提供一种含有所述的含黄素单加氧酶基因的表达盒。

8、本发明的第六方面，提供一种含有所述的含黄素单加氧酶基因的重组表达载体。

9、本发明的第七方面，提供一种含有所述的含黄素单加氧酶基因的重组菌。

10、本发明的第八方面，提供所述的表达盒、所述的重组表达载体或所述的重组菌在调控大蒜蒜氨酸合成中的应用。

11、本发明的第九方面，提供一种调控植物蒜氨酸合成的方法，包括：

12、促进目的植物中含黄素单加氧酶基因表达，获得蒜氨酸含量高于目的植物的植株；

13、或者，将目的植物中的含黄素单加氧酶基因沉默或敲除，获得蒜氨酸含量低于目的植物的植株；

14、所述含黄素单加氧酶基因通过表达载体转入到目的植物中；

15、所述含黄素单加氧酶基因为如下i)～ii)任一项所示的核酸分子：

16、i)核苷酸序列是seq id no.1～seq id no.5任一项所示的核酸分子；

17、ii)除i)以外的编码seq id no.50～seq id no.54任一项所示氨基酸序列的核酸分子。

18、本发明的第十方面，提供所述调控植物蒜氨酸含量的方法在植物育种中的应用，所述植物为大蒜。

19、本研究所用的大蒜参考基因组来源为二水早(ncbigeo:gse145455)，以asfmo1(ncbino.ab924383.1)为参考序列在全基因组范围内鉴定asfmo基因。为鉴定大蒜fmo基因家族所有成员，首先根据大蒜基因组注释进行初步筛选，之后将初筛候选基因提交至蛋白质结构域预测网站pfam进行蛋白结构域的预测，然后利用在线网站interpro、smart进一步验证，最后在大蒜基因组中鉴定得到fmo成员，最终确定为asfmo。b类黄素单加氧酶具有典型的fad和nad(p)h两个二核苷酸结合结构域，在b类黄素单加氧酶参与的催化过程中始终与nadp+的结合，研究表明与nadp+的结合可能具有稳定黄素过氧化物中间体的作用。b类黄素单加氧酶可以将底物分子上的碳原子、硫原子和其他(杂)原子进行氧化，所以它也被叫做多功能含黄素的单加氧酶，它所参与的氧化反应具有立体、化学和区域特异性高的特征。

20、发明人基于植物fmos中典型的fad和nad(p)h两个二核苷酸结合结构域，最终鉴定到5个fmos成员(asa3g05097.1、asa4g04959.1、asa4g04963.1、asa5g05156.1、asa6g04803.1)，asa3g05097.1比ncbi no.ab924383.1编码蛋白的n端少11个氨基酸，分别命名为asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5(asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5基因的核苷酸序列分别为seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq idno.5，asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5基因编码的氨基酸序列分别为seq idno.50、seq id no.51、seq id no.52、seq id no.53和seq id no.54，具体见核苷酸序列表)具体见核苷酸序列表)。此外，fmos成员均存在四个保守基序(fad-binding、nadp-binding、tgy和fmo-identifying)。进一步序列比对发现5个fmos成员均含有fad-binding、nadp-binding、tgy和fmo-identifying特征序列，与b类黄素单加氧酶的四个保守基序一致，其中fad结合基序和tgy基序的保守性极高。此外asfmo1蛋白在氨基酸序列155-160位置相比于其他4个成员多一个nadp结合基序(gggeeg)。简要过程如下：

21、1.asfmo1和asfmo2基因过表达载体的构建

22、为了鉴定asfmo1和asfmo2在蒜氨酸生物合成中起关键作用。利用金乡四六瓣的rna反转录的cdna作为模板，

23、asfmo1引物对：

24、正向引物-1(seq id no.6)：5'-cggatccgatggtttcctcatct-3'；

25、反向引物-1(seq id no.7)：5'-cccgggtgaaagaaatttgctgaa-3'；

26、asfmo2引物对：

27、正向引物-2(seq id no.8)：5'-cgggatccatggtctctgaatatatcaactcc-3'；

28、反向引物-2(seq id no.9)：5'-tcccccgggtattttaataacatctggatctagctg

29、-3'；

30、进行pcr扩增出1300bp左右的条带，经测序长度分别为1374bp和1371bp，获得asfmo1基因和的asfmo2基因的cds序列。

31、将扩增后的目的条带胶回收后，利用t4连接酶与双酶切后的pcombia3300-egfp载体相连，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆进行菌液pcr并测序。

32、2.asfmo1和asfmo2基因crispr/cas9的构建

33、利用在线网站ssc预测合适的高分靶点，并对靶点序列进行比对，选择特异性好的靶点。按此原则，最终在asfmo1和asfmo2基因的编码区上各选择了2个靶点，asfmo1的靶点1的序列为5′-tttgtggagaaaacgaacgg-3′(seq id no.10)，靶点2的序列为5′-tggaagggaaaagatggagg-3′(seq id no.11)；asfmo2的靶点1的序列为5′-aattctccgagggagatcat-3″(seq id no.12)，靶点2的序列为5′-tgtaggcatgacgaatacca-3′(seq id no.13)。载体构建过程中包含两个反应：第一个反应是以sv-cas9载体(crispr/cas9载体)为模板，用含靶点的引物进行扩增；第二个反应是以第一步的扩增产物为模板进行扩增，随后纯化pcr产物，利用无缝克隆技术与单酶切的sv-cas9载体进行连接，转化大肠杆菌。经菌液pcr的初步筛选，得到多个阳性克隆，将测序结果利用dnaman进行比对，确认正确的单克隆，获得含有正确靶点的sv-cas9载体。

34、3.转基因株系的获得

35、获得上述的目标载体后，选择大蒜根尖诱导的胚性愈伤组织为受体材料，用农杆菌介导法将重组质粒sv-cas9-asfmo1-bar、sv-cas9-asfmo2-bar和pcombia3300-asfmo1-egfp、pcombia3300-asfmo2-egfp转入到大蒜中。将分别含有重组质粒sv-cas9-asfmo1-bar、sv-cas9-asfmo2-bar和pcombia3300-asfmo1-egfp、pcombia3300-asfmo2-egfp的lba4404农杆菌活化后；利用侵染液侵染继代次数少于2次的胚性愈伤组织，获得了asfmo1和asfmo2转基因过表达株系和转基因敲除株系。提取转化后植株与未转化植株的基因组，分别以重组质粒sv-cas9-asfmo1-bar、sv-cas9-asfmo2-bar和pcombia3300-asfmo1-egfp、pcombia3300-asfmo2-egfp为阳性对照，以未转化的大蒜叶片基因组为阴性对照，以水为空白对照，通过使用特异性引物分别对其进行pcr检测，分别获得5株t0代植株。敲除突变体株系通过pcr扩增除草剂基因bar片段表明外源基因已整合到基因组，目的片段发生基因编辑时间，asfmo1突变体株系按顺序依次命名为asfmo1-1和asfmo1-2；asfmo2的突变体株系依次命名为asfmo2-1和asfmo2-2。过表达株系通过pcr扩增egfp基因表明外源基因已整合到基因组，asfmo1转基因株系按顺序依次命名为oe-1、oe-2和oe-3；asfmo2转基因株系按顺序依次命名为oe-4、oe-5和oe-6。

36、取t0代转基因株系与未转化植株的幼嫩的叶提取rna并反转录，通过荧光定量pcr检测asfmo1基因和asfmo2基因表达量。在asfmo1和asfmo2基因表达量方面，与未转化植株相比，asfmo1-1、asfmo1-2突变体株系asfmo1基因表达明显下调，asfmo2-1和asfmo2-2突变体株系asfmo2基因表达明显下调，asfmo1过表达株系表达上调3倍，asfmo2过表达株系表达上调2.5倍。在蒜氨酸含量方面，与未转化的植株相比，asfmo1过表达株系提高了82％，突变体株系下降了37％；asfmo2过表达株系提高了50％，突变体株系下降了27％。

37、根据最终测定蒜氨酸含量，结合asfmos基因家族的生物信息学分析和表达特征分析，蒜氨酸生物合成中的含黄素单加氧酶为asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5。由于asfmo1和asfmo2蛋白结构极其相似，并且均在鳞茎膨大期的叶片中表达量最高，因此asfmo1和asfmo2是蒜氨酸合成的关键基因。

38、本发明的有益效果：

39、本发明根据二水早大蒜基因组注释信息初步筛选出49条fmos候选序列，基于植物fmos中典型的fad和nad(p)h两个二核苷酸结合结构域，最终鉴定到5个fmos成员：asfmo1、asfmo2、asfmo3、asfmo4和asfmo5(seq id no.1～5)，并从中鉴定出两个特别优异的基因asfmo1和asfmo2(seq id no.1～2)。本研究揭示了大蒜蒜氨酸生物合成关键基因，并利用大蒜遗传转化方法获得高蒜氨酸含量和低蒜氨酸含量的转基因大蒜，为大蒜育种工作做出了贡献，具有实际应用价值。