一种重组蛋白及其用活细胞免疫荧光法在抗乙酰胆碱受体簇抗体检测中的应用的制作方法

本发明是一种重组蛋白及其用活细胞免疫荧光法在抗乙酰胆碱受体簇（achr簇）抗体检测中的应用，具体涉及一种将achrα1亚基、achrβ亚基、achrδ亚基、achrε亚基/achrγ亚基的部分序列融合表达到真核细胞的细胞膜上的重组蛋白，以及利用该重组蛋白在细胞膜上过表达后在活细胞免疫荧光法（live cell based assay，lcba法）中检测抗achr簇抗体的过程，属于生物医药工程。

背景技术：

1、重症肌无力（myasthenia gravis，mg）是一种影响运动系统的疾病，其原因是自身免疫产生的抗体攻击神经肌肉接头（nmj），导致自愿肌肉的神经肌肉传递减少。其病理生理学已被广泛了解；大多数自身抗体已被鉴定并且可以被检测到，并且通常是直接致病的。与该疾病过程相关的特征性症状包括运动或重复收缩时的肌肉无力。

2、乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，achr）是一种位于神经肌肉接头后突触末端的钠离子通道。在正常情况下，乙酰胆碱（ach）在神经信号传递中扮演重要角色，它在神经末梢释放后与肌肉细胞上的achr结合，导致钠离子通道打开，从而引起肌肉收缩。然而，当针对achr的抗体出现时，它们会与受体结合，并加速受体通道的翻转，这些抗体还会阻止乙酰胆碱与受体的结合。如果这些抗体结合了补体，它们会吸引吞噬细胞（如巨噬细胞），并导致神经肌肉接头的破坏，这种破坏会导致接头的褶皱结构丧失，而这种结构原本提供了一种空间优势，使得乙酰胆碱在与受体结合时更为有效。

3、achr是一种分子量约为250kda的糖蛋白，通过肌膜突起，由五个亚单位组成，排列成围绕中央通道的桶状棒状，并在胞内部分，与突触受体相关蛋白（receptor associatedprotein of the synapse，rapsyn）结合，以形成稳定正确的蛋白结构。rapsyn是骨骼肌的一种43-kda的外周膜蛋白，对于在突触后膜上聚集烟碱乙酰胆碱受体（nachr）至关重要。achr分为几个亚型，其中成人型的achr由两个α亚单位和β、δ、ε的亚单位各一个组成，胎儿型的ε亚单位被γ亚单位取代。achr的α亚单位（achrα）既包含乙酰胆碱结合的位点，也包含mg患者自反应t细胞和自身抗体识别的主要表位。此外，其余几个亚基也含有部分抗体识别表位。

4、目前，抗achr簇抗体的检测，主要采用放射免疫沉淀法（ripa法）和酶联免疫吸附测定法（elisa法）。其中，ripa法是使乙酰胆碱受体与125i-α-蛇毒素混合，在与待测血清孵育后，加入第二抗体沉淀125i-α-蛇毒素-achr-abs复合物，沉淀物被计数，并与使用健康对照血清的沉淀进行比较。该测试在全身型mg中的敏感性较高（超过85%），而在眼型mg中较低。ripa已成为测量抗achr抗体的参考，为了确保单个检测能够覆盖抗成人和抗婴儿抗体，抗原制备中应包含这两种抗原。由于ripa法操作复杂，需要的实验室配置在很多临床检验机构中无法实现，因此通常会选择elisa法来替代部分achr抗体的检测。

5、elisa法是在achr抗原包被的孔中加入待测血清，然后加入标记有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的第二抗体，经过洗涤后，加入显色剂。这种方法相比ripa法的优势在于不需要处理放射性同位素。但使用elisa技术和ripa技术并不总是得到相同的结果。在以往发表的文献中发现，与ripa法检测相比，elisa法的检测存在一定比例的假阴性率和假阳性率。

6、随着对achr抗体的进一步研究发现，在80%-85%的全身性mg（gmg）患者中，抗体直接针对乙酰胆碱受体（achr），也有一小部分患者（5%-8%）有针对肌肉特异性激酶（musk）的抗体，其余患者（约10%)被称为“血清阴性”（sn）mg。这些抗体无法通过经典的ripa和elisa技术进行检测，但可以通过细胞免疫荧光法（cell based assay，cba法），在转染了achr亚基和rapsyn表达载体的细胞上检测，被称为achr的cba法检测。cba法需要将具有与待测抗体具有特异性结合能力的抗原蛋白在细胞过表达构建表达重组蛋白的特定细胞系。

7、针对achr的cba法检测，可以采用固定细胞免疫荧光法（fixed cell basedassay，fcba）或活细胞免疫荧光法（live cell based assay，lcba），其中lcba方法，灵敏度更高，而且能检测到部分snmg患者中的achr抗体，但是难点在于，该方法目前需要将achr的五个亚基（α、β、δ、ε/γ）和rapsyn进行共转，想要获得稳定过表达共转基因的细胞系难度极大，如果采用质粒介导的瞬时转染，六个质粒同时转染高表达在同个细胞内的概率低，其表达水平肯能存在较大差异，可能存在某个亚基表达水平高，而另一个亚基表达水平低的现象；此外，lcba法对于细胞状态要求较高，瞬时转染的细胞，往往由于转染试剂的毒性和瞬时高表达的蛋白，导致细胞不健康或死亡，用lcba法操作时效果不好，在对临床mg样本检验时，由于患者抗体的多样性，降低了检测灵敏度，导致检出率低。

8、现有技术文献：

9、中国专利cn113651881a；

10、中国专利cn113687067a。

11、综上，现有技术无法实现将achr的五个亚基（α、β、δ、ε/γ）同时以包括正确抗原结构域部分的结构和共聚体形态表达在细胞膜上，并能以较高的灵敏度和准确性用于检测人类生物样本中抗achr簇抗体水平的检验技术。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种重组蛋白及其用活细胞免疫荧光法（lcba法）在抗乙酰胆碱受体簇抗体检测中的应用，通过从achrα1亚基、achrβ1亚基、achrδ亚基和achrε亚基（或achrγ亚基）中截取部分序列进行重新设计并融合表达，且不需要和rapsyn进行共转，该融合表达的蛋白在真核细胞的细胞膜上能够稳定过表达，同时可以在采用lcba法检测抗乙酰胆碱受体簇（achr）抗体时，满足临床检测要求。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、一种重组蛋白，该重组蛋白分别针对成人型（achrε）和婴儿型（achrγ）两种异构体设计了不同结构的两种重组蛋白，即成人型achr重组蛋白和婴儿型achr重组蛋白，分别如下：

4、将achrα1亚基、achrβ1亚基、achrδ亚基和achrε亚基的部分序列融合构建得到序列号如seq id no：1所示的成人型achr重组蛋白，

5、或者，将achrα1亚基、achrβ1亚基、achrδ亚基和achrγ亚基的部分序列融合构建得到序列号如seq id no：2所示的婴儿型achr重组蛋白。

6、上述achrα1亚基、achrβ1亚基、achrδ亚基和achrε亚基（或achrγ亚基）的部分序列分别截取自其特定结构域的氨基酸序列，具体如下：

7、achrα1亚基的部分序列包括如seq id no：3所示的含信号肽的achrα1亚基部分序列，以及如seq id no：4所示的不含信号肽的achrα1亚基部分序列；

8、achrβ1亚基的部分序列如seq id no：5所示；

9、achrδ亚基的部分序列如seq id no：6所示；

10、achrε亚基的部分序列如seq id no：7所示；

11、或achrγ亚基的部分序列如seq id no：8所示。

12、进一步的，可利用连接肽，将含信号肽的achrα1亚基部分序列、achrβ1亚基的部分序列、achrδ亚基的部分序列、不含信号肽的achrα1亚基部分序列、achrε亚基的部分序列、跨膜序列和荧光标签依次连接融合，构建成人型achr重组蛋白，

13、或者，利用连接肽，将含信号肽的achrα1亚基部分序列、achrβ1亚基的部分序列、achrδ亚基的部分序列、不含信号肽的achrα1亚基部分序列、achrγ亚基的部分序列、跨膜序列和荧光标签依次连接融合，构建婴儿型achr重组蛋白。

14、在构建上述成人型achr重组蛋白或婴儿型achr重组蛋白时使用的连接肽具体包括：

15、连接肽a：用于连接含信号肽的achrα1亚基部分序列和achrβ1亚基的部分序列，连接achrβ1亚基的部分序列和achrδ亚基的部分序列，连接achrδ亚基的部分序列和不含信号肽的achrα1亚基部分序列，连接不含信号肽的achrα1亚基部分序列和achrε亚基的部分序列，以及连接不含信号肽的achrα1亚基部分序列和achrγ亚基的部分序列；

16、连接肽b：用于连接achrε亚基的部分序列和跨膜序列，以及连接achrγ亚基的部分序列和跨膜序列；

17、连接肽c：用于连接跨膜序列和荧光标签。

18、进一步的，连接肽a的序列如seq id no：9所示；连接肽b的序列如seq id no：10所示；连接肽c的序列如seq id no：11所示。

19、可选的，所述跨膜序列为cd8a hinge。

20、可选的，所述荧光标签为mcherry。

21、本发明还提供了基于上述重组蛋白用lcba法在抗乙酰胆碱受体簇抗体检测中的应用，采用lcba法，将编码重组蛋白的核酸转染宿主细胞进行表达而获得的共转染细胞作为检测产品进行抗乙酰胆碱受体簇抗体的检测。

22、可选的，所述宿主细胞包括cho细胞或hek293细胞。

23、可选的，所述检测产品包括检测试剂或检测试剂盒。

24、本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

25、（1）本发明通过截取achr五个亚基（α、β、δ、ε/γ）中的特定部分序列，利用连接肽重新设计并融合跨膜序列和荧光标签而构建形成重组蛋白，可实现在真核细胞的细胞膜上稳定过表达。

26、（2）本发明融合构建的重组蛋白锚定于细胞膜上，不需要进行多个亚基的共同转染，也不需要使用rapsyn进行共转，仅需一次转染，极易得到稳定表达抗原构象的稳定细胞系，可用于fcba法和lcba法检测抗achr抗体的过程，对于该抗体的检测和snmg患者的检测，具有重要的作用。

27、（3）本发明针对成人型（achrε）和婴儿型（achrγ）两种异构体分别设计了两种融合表达的重组蛋白，即成人型achr重组蛋白和婴儿型achr重组蛋白，适用于成人和婴儿两种不同患者人群的抗achr抗体的检测，适用范围广。